復方柴金解郁片對慢性溫和不可預知性應激抑郁大鼠海馬突觸可塑性的影響

韓遠山，李萍，王宇紅，李姿蓉，鄒蔓姝，李春艷，牟晴蕊

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙410208

抑郁癥是一類以持續(xù)情緒低落、思維遲緩、意志力減退為臨床表現(xiàn)的精神類疾病，為發(fā)作性疾病，可單次或反復發(fā)作。據(jù)統(tǒng)計，抑郁癥在中國的患病率約為3.02%，是全球疾病負擔的主要原因之一，預計在2030年將上升至世界疾病負擔首位。研究表明，海馬突觸可塑性改變與抑郁癥密切相關，其中膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）和樹突棘素（Spinophilin）對于調(diào)控海馬突觸可塑性意義重大。課題組前期研究顯示，復方柴金解郁片治療抑郁癥肝郁脾虛證效果肯定，不良反應少，安全性較高。藥理研究表明，復方柴金解郁片通過降低海馬神經(jīng)元突觸素-α和突觸素后致密物-95蛋白和mRNA表達、減少炎癥因子分泌，促進海馬神經(jīng)元突觸損傷修復，發(fā)揮抗抑郁作用。本研究采用慢性溫和不可預知性應激結(jié)合孤養(yǎng)建立抑郁大鼠模型，觀察復方柴金解郁片對模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響，進一步明確其作用機制，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號1107272011006598，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，使用許可證號SYXK（湘）2019-0009，室溫（24±2）℃，相對濕度（50±5）%，光暗周期12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物

復方柴金解郁片浸膏（柴胡、貫葉金絲桃、姜黃、紫蘇葉、白芍、知母），湖南中醫(yī)藥研究院提供，每克浸膏相當于3.92 g原藥材，臨用前用蒸餾水稀釋成濃度分別為1.134、0.567、0.284 g/mL。鹽酸文拉法辛緩釋膠囊，蘇州惠氏制藥有限公司，75 mg/粒，批號T37944D，臨用前用蒸餾水配制成濃度為1.35 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

GDNF抗體，英國Abcam公司，批號GR279460-6；Spinophilin抗體，江蘇親科生物科技有限公司，批號76m9086；GAPDH 抗體，北京博奧森，批號BJ09 211758；BCA蛋白定量檢測試劑盒、凝膠制備試劑盒、HRP標記山羊抗兔IgG，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為G2026、G2003、GB23303。YLS-9A電子刺激儀，濟南益延科技有限公司；JJ-12J脫水機、JB-P5包埋機、JB-L5凍臺，武漢俊杰電子有限公司；RM2016 病理切片機，上海徠卡；Eclipse E100正置光學顯微鏡、DS-U3成像系統(tǒng)，日本尼康公司；RT-6100酶標儀，美國Rayto公司；WGXYQ0004封口機，武漢賽維爾生物科技有限公司；6300化學發(fā)光儀，上海勤翔科學儀器有限公司；CRYOSTAR NX50 冰凍切片機，美國Thermo 公司；Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀，匈牙利3DHistech公司。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后進行糖水消耗實驗。將糖水消耗量接近的60只大鼠隨機分為空白組、模型組、文拉法辛組和復方柴金解郁片高、中、低劑量組，每組10 只。除空白組外，其余各組大鼠均單籠飼養(yǎng)，采用慢性溫和不可預知性應激復制抑郁模型，應激因素包括：電擊1 min，夾尾1 min，4 ℃冰水浴4 min，晝夜顛倒24 h＋潮濕墊料，禁食24 h，禁水24 h，傾籠45°24 h＋噪音4 h，每種應激方式3 d 內(nèi)不重復出現(xiàn)。造模同時，文拉法辛組按13.5 mg/kg灌胃給藥，復方柴金解郁片高、中、低劑量組按11.34、5.67、2.84 g/kg 灌胃相應藥液，灌胃體積10 mL/kg，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)42 d。

2.2 行為學實驗

2.2.1 糖水消耗實驗

第28日和第42日灌胃1 h后進行糖水消耗實驗，每次糖水消耗實驗持續(xù)4 d。實驗第1日，單籠左右兩側(cè)均放置1%糖水瓶；第2日上午將左側(cè)換為蒸餾水瓶，下午將左右兩側(cè)水瓶交換位置；第3日禁水24 h；第4日稱量兩水瓶質(zhì)量，左側(cè)放置糖水瓶，右側(cè)放置蒸餾水瓶，30 min后將兩水瓶位置互換，計時30 min，將兩水瓶取下，稱重，計算1 h 內(nèi)大鼠糖水偏好度。糖水偏好度（%）＝糖水攝入量÷（糖水攝入量＋蒸餾水攝入量）×100%。

2.2.2 曠場實驗

第28 日和第42 日，將曠場箱（80 cm×80 cm×40 cm）底面劃分為5×5的小方格，將大鼠從曠場箱中心放入，適應30 s后，觀察記錄大鼠4 min內(nèi)水平活動次數(shù)（三爪進入方格）和垂直活動次數(shù)（兩前肢騰空或攀爬箱壁），水平活動次數(shù)和垂直活動次數(shù)總和為總活動次數(shù)。

2.2.3 強迫游泳實驗

第28日和第42日，采用直徑20 cm、高50 cm的透明圓柱形水缸，裝入適量常溫水，將大鼠頭部朝下放入水缸中，適應30 s后，觀察并記錄大鼠4 min內(nèi)游泳不動時間（大鼠漂浮在水面，四肢沒有明顯活動或有輕微活動，僅為保持頭露出水面，而沒有水平位移）。

2.3 取材

第42日行為學實驗結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，各組取6只大鼠，腹主動脈取血，冰盒上剝離全腦后分離海馬，置于液氮中保存?zhèn)溆?。剩?只大鼠先后心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛溶液，待大鼠四肢僵硬后取全腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，室溫保存。

2.4 HE染色

將海馬組織修復平整后脫水浸蠟，包埋，切片（4 μm）；將切片依次放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，自來水洗；常規(guī)HE染色，脫水封片后顯微鏡下觀察。

2.5 高爾基染色

取固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織，沿冠狀面切取交叉視神經(jīng)根部與腦四疊體之間部分，切成2～3 mm組織塊，生理鹽水漂洗，高爾基染液將腦組織完全浸沒，避光處理14 d；蒸餾水浸洗3次，80%冰醋酸浸泡過夜，待組織變軟后蒸餾水浸洗，置于30%蔗糖溶液中，低溫避光脫水2 d；將組織切成100 μm薄片，貼于明膠玻片上，避光晾干，濃氨水處理15 min，蒸餾水洗1 min，酸性堅膜定影液處理15 min，蒸餾水洗3 min，晾干，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察。

2.6 Western blot檢測

取適量海馬組織，加入裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度；加入適量上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min使蛋白變性；根據(jù)蛋白分子量對應范圍配制分離膠，上樣，60 V電泳至濃縮膠與分離膠分界處，80 V電泳至溴酚蘭到達分離膠底部；轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入GDNF、Spinophilin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育30～60 min；TBST洗膜，ECL法顯色，使用Image J 軟件測量各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 復方柴金解郁片對模型大鼠行為學指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠第28、42日糖水偏好度顯著降低，總活動次數(shù)減少，游泳不動時間顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，文拉法辛組大鼠第28、42日糖水偏好度顯著升高，總活動次數(shù)顯著增加，第42日游泳不動時間顯著減少，復方柴金解郁片高劑量組大鼠第28日糖水偏好度顯著升高，總活動次數(shù)顯著增加，游泳不動時間顯著減少，復方柴金解郁片中、低劑量組大鼠第42日糖水偏好度顯著升高，總活動次數(shù)顯著增加，游泳不動時間顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠行為學比較（）

3.2 復方柴金解郁片對模型大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠海馬錐體細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊密集，胞核大而圓，核仁清晰，細胞質(zhì)豐富，未見明顯炎性改變；模型組大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)錐體細胞胞核固縮，形狀不規(guī)則，出現(xiàn)炎癥改變；文拉法辛組和復方柴金解郁片高、中、低劑量組大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)可見少量海馬錐體細胞胞核固縮，未見明顯炎癥改變，病變范圍較模型組減少。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織形態(tài)（HE染色，×400）

3.3 復方柴金解郁片對模型大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷的影響

空白組大鼠海馬神經(jīng)元較多，樹突較長且分支豐富；模型組大鼠海馬CA1、DG區(qū)部分神經(jīng)元消失，樹突分散、排列疏松或纏攪，樹突棘數(shù)量減少或缺失，以海馬DG區(qū)損傷最顯著；文拉法辛組和復方柴金解郁片高、中、低劑量組大鼠海馬神經(jīng)元突觸損傷有所改善，樹突棘和樹突分支數(shù)量增加。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬樹突棘形態(tài)（高爾基染色，×400）

3.4 復方柴金解郁片對模型大鼠海馬組織膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和樹突棘素蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織GDNF、Spinophilin 蛋白表達顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，文拉法辛組和復方柴金解郁片中、低劑量組大鼠海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01），復方柴金解郁片高劑量組大鼠海馬組織GDNF蛋白表達顯著升高（＜0.01）。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白免疫印跡

表2 各組大鼠海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白表達比較（）

4 討論

抑郁癥機制目前廣泛認可的有炎癥反應學說、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體學說、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能失調(diào)學說、神經(jīng)營養(yǎng)因子學說等，多種因素通過不同信號途徑、生理病理過程相互作用，最終導致突觸數(shù)量減少和功能損傷，以致發(fā)生抑郁。海馬與學習、記憶、行為和情緒密切相關，是抑郁癥研究的關鍵靶器官。前期研究表明，復方柴金解郁片對抑郁大鼠海馬神經(jīng)元突觸功能及結(jié)構(gòu)損傷具有改善作用。本實驗通過行為學、病理學、分子生物學檢測方法，探討該方對抑郁大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷及海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白表達的影響。

GDNF 來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是一種在體內(nèi)廣泛表達的多效能神經(jīng)營養(yǎng)因子，對受損神經(jīng)元具有修復、保護作用，能促進神經(jīng)元存活、神經(jīng)祖細胞分化及突觸形成。有研究顯示，GDNF 及其受體在海馬和前額葉皮質(zhì)呈高表達，GDNF 基因敲除小鼠表現(xiàn)為海馬突觸傳遞功能異常，水迷宮學習能力明顯受損。樹突棘位于興奮性突觸后膜，其形態(tài)、數(shù)量變化對突觸可塑性有直接影響。Spinophilin 是一種表達于樹突棘內(nèi)的神經(jīng)支架蛋白，參與樹突棘可塑性調(diào)節(jié)，與樹突棘形態(tài)、數(shù)目及興奮性突觸的傳遞密切相關，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用。Spinophilin 基因敲除大鼠雖然有完整的感覺信息加工傳遞過程，但是聯(lián)想學習能力、厭惡型條件反射學習能力與野生型大鼠相比明顯受損，表明Spinophilin 對學習認知過程具有重要影響。本研究顯示，與空白組比較，模型組大鼠海馬組織樹突棘和樹突分支數(shù)量減少，突觸形態(tài)損傷，GDNF、Spinophilin蛋白表達顯著降低；與模型組比較，復方柴金解郁片各劑量組大鼠海馬組織樹突棘和樹突分支數(shù)量增加，突觸損傷有所改善，GDNF、Spinophilin蛋白表達顯著升高，表明復方柴金解郁片能一定程度上修復海馬神經(jīng)元突觸損傷，改善神經(jīng)元突觸可塑性。然而，高劑量組作用較中、低劑量組弱，可能是由于高劑量藥物會產(chǎn)生更高濃度的代謝副產(chǎn)物，與藥效成分產(chǎn)生競爭性抑制作用，具體機制有待進一步研究。

抑郁癥可屬中醫(yī)學“郁證”“百合病”等范疇。復方柴金解郁片以柴胡為君，疏肝解郁；臣以貫葉金絲桃、姜黃，助君藥疏肝解郁；佐以紫蘇葉、白芍、知母理氣解郁、養(yǎng)血柔肝、滋陰除煩。全方共奏疏肝理氣、活血解郁之效。

綜上，復方柴金解郁片能改善抑郁模型大鼠抑郁癥狀，修復海馬神經(jīng)元損傷，增加樹突棘和樹突分支數(shù)量，上調(diào)海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白表達，進而調(diào)控海馬神經(jīng)元突觸可塑性，發(fā)揮抗抑郁作用。本研究初步揭示了復方柴金解郁片抗抑郁的作用機制，可為該方的進一步研究奠定基礎。