桑葉1-脫氧野尻霉素含量快檢方法建立及其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

叢凱平，李婷婷,2*，吳彩娥,2，范龔健,2，王佳宏,2，索安迪

(1. 南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，南京 210037; 2. 南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037)

桑(MorusalbaL.)屬?？疲份d于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥的功能。桑葉別名“鐵扇子”，歷代中醫(yī)藥書籍中記載其能夠治療消渴癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)，桑葉中存在大量的生物堿、多糖和黃酮等活性物質(zhì)，不僅可用于治療Ⅱ型糖尿病、肥胖癥等疾病[2]，還被應(yīng)用于抗炎、抗病毒和抗腫瘤轉(zhuǎn)移等多個醫(yī)療領(lǐng)域[3]。

1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)[4]是一種多羥基生物堿類型化合物，具有較好的抑制糖苷酶活性，其親和性比麥芽糖、蔗糖強(qiáng)，主要表現(xiàn)在小腸內(nèi)與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，對二糖與葡萄糖苷酶的反應(yīng)存在著競爭性遏制，能夠降低麥芽糖和蔗糖等二糖在小腸中的水解度，抑制人體腸道對單糖的吸收，有效降低人們進(jìn)食后的血糖水平[5]。

目前，用來檢測桑葉中DNJ含量的方法有很多。例如，王建山等[6]采用液相串聯(lián)質(zhì)譜法分析DNJ含量，但成本高，應(yīng)用普及性低；李繼文等[7]采用柱前衍生化法測定DNJ含量，但操作煩瑣，穩(wěn)定性差；陳智毅等[8]采用離子色譜法測定DNJ含量，缺點(diǎn)是電化學(xué)檢測器選擇性低，靈敏度較低。為此，筆者建立了一種高效可靠且成本較低的快速檢測桑葉中DNJ含量的方法，比較不同地域與品種的桑葉中DNJ含量，并研究其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及類型。從含量、對α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制類型多方面研究桑葉DNJ，這對提高我國桑的經(jīng)濟(jì)效益和促進(jìn)桑的產(chǎn)業(yè)升級具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種不同地域桑葉(沁縣桑葉、陽城桑葉和韓國桑葉)均為普通飼蠶桑，分別購自山西沁縣、山西陽城和韓國桑葉基地，3種不同品種桑葉(果桑、葉桑和蛋白桑)均購自山西沁縣桑葉基地。DNJ，色譜純(純度98%)，購自上海阿拉丁生化科技有限公司；732型陽離子樹脂，購自北京索萊寶公司；α-葡萄糖苷酶，購自上海源葉公司；葡萄糖測定試劑盒，購自海榮盛公司；乙醇、碳酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 桑葉中DNJ含量快速檢測方法的建立

1)原料預(yù)處理。將干制桑葉粉碎后過80目(孔徑為0.178 mm)篩。取一定質(zhì)量桑葉粉末，以質(zhì)液比1∶20(g∶mL)加入60%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液，超聲輔助提?。浑x心后保留上清液。再次以質(zhì)液比1∶30向沉淀中加入80%的乙醇溶液，4 ℃靜置過夜；離心后取上清液，合并上清液低溫減壓除醇，并溶于水中；以0.5 mol/L的氨水為洗脫液，過732型鈉離子交換樹脂，流速為1.5 mL/min，洗脫液減壓濃縮冷凍干燥備用。經(jīng)測定，上述樣品中DNJ的純度為85%左右，以下簡稱為桑葉提取物。

2)色譜條件。色譜柱為Waters HILIC Silica Column(粒徑為5 μm，內(nèi)徑×柱長為4.6 mm×150 mm)；柱溫30 ℃、流速0.2 mL/min、進(jìn)樣量10 μL；流動相為乙腈和水(體積比85∶15)；蒸發(fā)光檢測器漂移管溫度52 ℃、氮?dú)鈮毫?75.8 kPa、增益60；噴霧器模式為冷卻。

3)DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱量1 mg的DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈和水(體積比1∶1)溶液定容于10 mL容量瓶中，搖勻，獲得質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL 的DNJ對照品溶液；用乙腈和水(體積比1∶1)稀釋成質(zhì)量濃度為1.0～12.0 μg/mL的梯度溶液，過0.22 μm濾膜，取10 μL進(jìn)行色譜分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1×106e0.05x，決定系數(shù)R2=0.999 4。

4)方法學(xué)考察。靈敏性檢測，分別取1，2，4，8和10 μL的100.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析，依據(jù)所得色譜圖確定DNJ的最低檢測量及最佳峰型對應(yīng)進(jìn)樣量，考察該方法的靈敏性；精密度檢測，取10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，記錄色譜峰面積并且計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算該方法的精密度；穩(wěn)定性檢測，取10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次放置0，2，4，6，8和10 h，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積并且計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察該方法的穩(wěn)定性；重現(xiàn)性檢測，取10.0 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，記錄色譜峰面積和保留時間并且計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察該方法的重現(xiàn)性。

1.3 桑葉中DNJ含量的測定

用乙腈和水(體積比1∶1)將上述桑葉提取物定容于5 mL容量瓶中，作為供試品溶液；過0.22 μm膜，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析。

1.4 α-葡萄糖苷酶反應(yīng)體系的優(yōu)化

根據(jù)α-葡萄糖苷酶對反應(yīng)體系的要求，選擇反應(yīng)底物濃度、酶用量和反應(yīng)時間3個反應(yīng)條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，建立最優(yōu)反應(yīng)體系。

1)最適底物濃度：建立0.5 mL的反應(yīng)體系，反應(yīng)底物為0.2 mL蔗糖溶液，反應(yīng)底物質(zhì)量濃度設(shè)置為0，1，2，4，8，16，32，36和40 mg/mL，37 ℃水浴10 min，加入0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴60 min，65 ℃水浴加熱2 min終止反應(yīng)。使用葡萄糖測定試劑盒測定葡萄糖含量。

2)最適酶用量：建立0.5 mL的反應(yīng)體系，反應(yīng)底物為0.2 mL的32 mg/mL蔗糖溶液，37 ℃水浴10 min，分別加入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴60 min，65 ℃水浴加熱2 min終止反應(yīng)。使用葡萄糖測定試劑盒測定葡萄糖含量。

3)最適反應(yīng)時間：建立0.5 mL的反應(yīng)體系，反應(yīng)底物為0.2 mL的32 mg/mL蔗糖溶液，37 ℃水浴10 min，加入0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，分別在37 ℃下水浴0，10，20，30，40，50，60，80和100 min，65 ℃水浴加熱2 min終止反應(yīng)。使用葡萄糖測定試劑盒測定葡萄糖含量。

1.5 桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率

使用磷酸鉀緩沖液將上述桑葉提取物樣品定容至50 mL，得到20.0 mg/mL的桑葉提取物溶液，并將其稀釋成質(zhì)量濃度為1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0 和20.0 mg/mL的一系列梯度溶液。按照上述最佳反應(yīng)體系，加入0.2 mL的32 mg/mL的蔗糖溶液，再加入0.1 mL樣品，37 ℃水浴10 min，加入0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴60 min，65 ℃水浴加熱2 min終止反應(yīng)。使用葡萄糖測定試劑盒測定葡萄糖含量，并根據(jù)公式計(jì)算桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制率，公式如下：

(1)

式中：A1為505 nm下不添加抑制劑的吸光值；A2為505 nm下添加酶抑制劑的吸光值；A0為空白對照組505 nm下的吸光值。

1.6 桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型

以5.0 mg/mL沁縣桑葉提取物為例，以磷酸緩沖液為空白對照，觀察當(dāng)α-葡萄糖苷酶的酶活在0～29.0 U/mL范圍內(nèi)在505 nm下的吸光值。采用酶反應(yīng)動力學(xué)的分析方法，α-葡萄糖苷酶的酶活為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖，通過觀察直線是否通過原點(diǎn)，判斷該反應(yīng)是可逆性抑制還是不可逆性抑制：若通過原點(diǎn)，則為可逆性抑制；若不通過原點(diǎn)，則為不可逆性抑制。

控制α-葡萄糖苷酶活為0.4 U/mL，加入等體積的5.0 mg/mL沁縣桑葉提取物，以磷酸緩沖液為空白對照，觀察當(dāng)?shù)孜餄舛仍?～0.50 mol/L變化過程中，各反應(yīng)體系505 nm下的吸光值(A505)。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖[9]，以蔗糖濃度的倒數(shù)(1/S)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo)，觀察兩直線的交點(diǎn)，判斷該反應(yīng)抑制作用類型為競爭性抑制還是非競爭性抑制：若交點(diǎn)在縱軸上，則為競爭性抑制；若在橫軸上，則為非競爭性抑制。具體計(jì)算公式如下：

(2)

式中：S為蔗糖濃度，mol/L；Vmax為最大反應(yīng)速率，mol/(L·min)；Km為米氏常數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 22.0軟件分析，均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Tukey’s檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

筆者建立HPLC-ELSD的方法來快速檢測桑葉中DNJ的含量，通過峰面積和保留時間來考察該方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性、出峰時間準(zhǔn)確性，經(jīng)過5次平行實(shí)驗(yàn)，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.21%，0.19%，0.19%和1.44%，均小于 2.00%。由此可知，該方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好。DNJ標(biāo)準(zhǔn)品和桑葉提取物的色譜圖見圖1。該方法檢測DNJ的最低檢測量為1 μL，較為靈敏，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時峰形最好，說明該方法靈敏度可達(dá)到該實(shí)驗(yàn)需求，可靠性高。

圖1 DNJ標(biāo)品和桑葉提取物的高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of DNJ and the extract mulberry leaves

2.2 桑葉中DNJ的含量

不同地域和不同品種桑葉中DNJ的含量如圖2所示。不同地域桑葉中DNJ的含量由高到低分別為沁縣桑、陽城桑和韓國桑，依次為2.419，1.937和1.205 mg/g，沁縣桑葉與陽城桑葉、陽城桑葉與韓國桑葉之間均具有顯著性差異(P<0.05)。這說明不同地域桑葉中DNJ的含量不同，這一結(jié)論與陸城宇等[10]的研究結(jié)論一致。由此推測，影響桑葉中DNJ含量的因素可能與產(chǎn)地氣候、土壤條件等有關(guān)，如溫度、濕度、降水量和施肥情況等。

不同品種桑葉中DNJ的含量由高到低分別為果桑、蛋白桑和葉桑，DNJ含量依次為2.694，2.408和1.623 mg/g，果桑和蛋白桑之間沒有顯著性差異(P>0.05)，蛋白桑和葉桑之間具有顯著性差異(P<0.05)，且果桑和蛋白桑中DNJ含量均遠(yuǎn)高于陜西周至‘育711號’桑樹(1.840 mg/g)[11]，是選育高DNJ含量的優(yōu)良品種。

注：不同小寫字母表示不同地域桑葉中DNJ含量具有顯著性差異(P<0.05)；不同大寫字母表示不同品種桑葉中DNJ含量具有顯著性差異(P<0.05)。圖2 不同地域/不同品種桑葉中DNJ的含量Fig. 2 The contents of DNJ in mulberry leaves in different regions/different wood species

2.3 α-葡萄糖苷酶反應(yīng)體系的優(yōu)化

底物濃度、酶用量和反應(yīng)時間對α-葡萄糖苷酶反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果如圖3所示。由圖3a可知，隨著底物蔗糖質(zhì)量濃度的增加，505 nm下的吸光值呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為32和36 mg/mL時，兩者差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇32 mg/mL為此反應(yīng)體系的底物質(zhì)量濃度。由圖3b可知，隨體系中酶用量的增加，505 nm下的吸光值先上升后平穩(wěn)，當(dāng)酶用量超過0.4 U/mL 時，505 nm下的吸光值沒有明顯改變，且酶用量為0.4和0.5 U/mL所對應(yīng)的吸光值差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇0.4 U/mL為最適酶用量。由圖3c可知，反應(yīng)時間大于60 min時，505 nm下的吸光值基本保持不變，當(dāng)反應(yīng)時間分別為60和80 min時，差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇60 min為此反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)時間。

圖3 底物濃度、酶用量和反應(yīng)時間對反應(yīng)體系中A505 nm的影響Fig. 3 Effects of substrate concentration, enzyme dosage and time on A505 nm of the reaction

2.4 桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

α-葡萄糖苷酶抑制劑可以用于Ⅱ型糖尿病的治療，通過抑制淀粉等碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖的過程，降低人體血液中的血糖值[12]。不同品種、不同地域桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率如圖4所示。由圖4可知，6種桑葉提取物均可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，這表明6種桑葉提取物都具有一定的降血糖作用，但它們之間存在差異。6種桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率在0～12.5 mg/mL范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度的增大而迅速升高，大于12.5 mg/mL后抑制率隨質(zhì)量濃度上升趨勢較為平緩。當(dāng)桑葉提取物質(zhì)量濃度大于12.5 mg/mL時，不同品種桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率由高到低依次為蛋白桑、葉桑和果桑(圖4a)，蛋白桑提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率為86.0%。當(dāng)桑葉提取物質(zhì)量濃度大于12.5 mg/mL時，不同地域桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率由高到低依次為沁縣桑、陽城桑和韓國桑(圖4b)，沁縣桑提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率為89.0%，為6種桑葉提取物中最高，僅略低于“降糖神茶”青錢柳的多糖提取物[13]。

注：不同大寫字母代表同種桑葉不同質(zhì)量濃度桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率具有顯著性差異；不同小寫字母代表同種質(zhì)量濃度不同種桑葉對α-葡萄糖苷酶抑制率具有顯著性差異。圖4 桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig. 4 Inhibitory effect of extract from mulberry leaf on α-glucosidase

沁縣桑葉中DNJ的含量比果桑低，但是沁縣桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率更高，可能與桑葉提取物中殘余多糖、黃酮等其他活性物質(zhì)有關(guān)。例如，桑葉中蘆丁也具有一定的調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[14]，所以，桑葉提取物的降血壓效果可能是幾種活性物質(zhì)的協(xié)同作用，但是DNJ占主導(dǎo)地位。該結(jié)論與胡玉城等[15]得出的結(jié)論基本一致。

2.5 桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型

當(dāng)無抑制劑時，速率直線通過原點(diǎn)；當(dāng)存在不可逆性抑制劑時，其速率直線不通過原點(diǎn)。然而，當(dāng)可逆性抑制劑存在且量恒定時，可得到一條直線，特點(diǎn)為通過原點(diǎn)而斜率較低[16]。由桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)曲線(圖5)可知，桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型是可逆性抑制。

圖5 桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)曲線Fig. 5 Inhibitory kinetic curves of extract from mulberry leaves on α-glucosidase

通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，判斷兩條直線的交點(diǎn)：若交點(diǎn)出現(xiàn)在縱軸上，則為競爭性抑制劑；交點(diǎn)出現(xiàn)在橫軸上，則為非競爭性抑制劑[17]。桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制雙倒數(shù)圖見圖6。由圖6可知，交點(diǎn)出現(xiàn)在橫軸上，說明其抑制作用類型是非競爭性抑制。

圖6 桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制雙倒數(shù)圖Fig. 6 Lineweaver-Burk plots of reversible inhibition of extract from mulberry leaves on α-glucosidase

3 結(jié) 論

筆者建立HPLC-ELSD的方法用來快速測定桑葉中DNJ的含量，經(jīng)驗(yàn)證，該方法快捷簡便、結(jié)果可靠，具有較高的精密度及準(zhǔn)確性和較好的重現(xiàn)性，具體結(jié)論如下：

1)通過測定6種桑葉中的DNJ含量，發(fā)現(xiàn)不同地域和不同品種桑葉中DNJ含量均存在差異，這說明，桑葉的產(chǎn)地和品種選育都會影響DNJ含量。在不同品種桑葉中，果桑中DNJ含量最高，為2.694 mg/g；在不同地域桑葉中，沁縣桑葉最高，為2.419 mg/g。

2)通過優(yōu)化底物濃度、酶用量和反應(yīng)時間，建立了α-葡萄糖苷酶的最佳反應(yīng)體系；在上述反應(yīng)體系下比較桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，沁縣桑葉最佳，其酶抑制率可達(dá)89.0%，桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率與桑葉中DNJ含量順序基本相同，但是略有差異?？赡艿脑蚴桥c桑葉提取物中殘留的其他活性物質(zhì)相關(guān)。

3)以沁縣桑葉DNJ為例，探究發(fā)現(xiàn)桑葉DNJ對α-葡萄糖苷酶抑制反應(yīng)類型為可逆性非競爭性抑制。通過研究DNJ在桑葉中的含量、對α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制類型，為日后桑葉DNJ的高效利用提供理論基礎(chǔ)。