黃芪注射液對(duì)病毒性心肌炎患者外周血Th17 及Treg 細(xì)胞亞群的影響*

楊聞君，羅秋林，張 強(qiáng)

1 重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院/江北區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400020；2 重慶市人民醫(yī)院；3 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院

病毒性心肌炎是由流感病毒、腮腺病毒及柯薩奇B 型病毒等引起的心肌局限性或彌漫性炎性病變。近年來(lái)，有研究顯示［1］，病毒性心肌炎發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與病毒感染后機(jī)體炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活密切相關(guān)。T 淋巴細(xì)胞是炎癥反應(yīng)激活與放大的重要組成部分，作為炎癥反應(yīng)的上游調(diào)控因子，參與了眾多炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［2］。其中，輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cell，Treg）是與炎癥性疾病發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)的重要T淋巴細(xì)胞亞群［3］。目前，對(duì)于病毒性心肌炎的治療，常以綜合治療（藥物、飲食及休息）為主，藥物治療方面，中西醫(yī)結(jié)合顯示出了獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［4］。特別是以黃芪注射液為代表的中成藥物，可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，提高臨床療效［5］，但黃芪注射液對(duì)Th17/Treg細(xì)胞亞群的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探討黃芪注射液對(duì)病毒性心肌炎患者外周血Th17/Treg 細(xì)胞亞群及相關(guān)下游炎性通路的影響，闡明其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料將2016年1月至2019年10月于重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院就診的病毒性心肌炎患者140 例根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組各70 例。觀察組中男37 例，女33 例；年齡35～78歲，中位年齡58.1 歲；平均病程（4.3±0.6）天；合并基礎(chǔ)疾病：高血壓43 例，糖尿病36 例，冠心病29 例。對(duì)照組中男35 例，女35 例；年齡35～79歲，中位年齡58.7 歲；平均病程（4.5±0.8）天；合并基礎(chǔ)疾病：高血壓45例，糖尿病35 例，冠心病28例。兩組患者性別、年齡、病程、基礎(chǔ)疾病等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。該研究獲得了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)并征得了患者書(shū)面知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)符合病毒性心肌炎診斷與治療指南［6］。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)1）患有冠心病、感染性心內(nèi)膜炎及心臟瓣膜病者；2）存在自身免疫性疾病和免疫缺陷者；3）惡性腫瘤患者；4）對(duì)黃芪注射液過(guò)敏者。

1.4 主要設(shè)備及試劑FACS型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號(hào)：11875119）、莫能霉素（貨號(hào)：00-4505-51）、淋巴細(xì)胞分離液（貨號(hào)：4414173）、細(xì)胞固定液（貨號(hào)：R37814）、細(xì)胞破膜劑（貨號(hào)：GAS002S5）均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；離子霉素（貨號(hào)：56092-81-0）、佛波酯（貨號(hào)：HY-18739）均購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress 公司；胎牛血清（美國(guó)HyClone 公司，貨號(hào)：PM150110）；單克隆抗體CD4（貨號(hào)：PA5-32324）、IL-17（貨號(hào)：PA1-86898）及CD25（貨號(hào)：MA1-12116）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17，貨號(hào)：H014-1）、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6，貨號(hào)：H007-1-1）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β，貨號(hào)：H034-1）酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)自中國(guó)南京建成生物公司。

1.5 治療方法

1.5.1 對(duì)照組 予抗病毒、維生素C 片、極化液、輔酶Q10 膠囊、鹽酸曲美他嗪片及抗心律失常等對(duì)癥及支持治療。共治療2周。

1.5.2 觀察組 在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加用黃芪注射液［哈爾濱圣泰生物制藥；國(guó)藥準(zhǔn)字Z23 020820；規(guī)格：10 mL/支（相當(dāng)于原藥材20 g）］20 mL，加入5%葡萄糖注射液250 mL 靜脈滴注，每日1 次。共治療2周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群水平檢測(cè) 抽取兩組患者治療前后靜脈血4 mL，經(jīng)肝素抗凝后，去抗凝血200 μL 于EP 管中，將其加入等體積的RPMI-1640 培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)板，同時(shí)加入佛波酯（30 μL，1 μg/mL）、離子霉素（16 μL，50 μg/mL）及莫能霉素（16 μL，0.1 mg/mL），培養(yǎng)箱中孵育4 h。取100 μL上述培養(yǎng)液，加入抗人CD4和CD25單克隆抗體10 μL，震蕩混勻后室溫避光孵育15 min，加入100 μL細(xì)胞固定液。再次室溫避光孵育15 min后，4 ℃離心半徑15 cm，2991 r/min 離心5 min，棄上清后加入100 μL 破膜液，同時(shí)加入IL-17 單克隆抗體10 μL 和Foxp3 抗體10 μL，震蕩混勻后，待上機(jī)檢測(cè)。

1.6.2 外周血炎性指標(biāo)檢測(cè) 治療前后采用ELISA法測(cè)定患者外周血IL-6、IL-7和TGF-β水平。

1.6.3 心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 治療前后檢測(cè)患者肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CKMB）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）及肌紅蛋白（myoglobin，MYO）。

1.6.4 療效標(biāo)準(zhǔn) 參照成人病毒性心肌炎診斷與治療指南標(biāo)準(zhǔn)［6］，依次分為臨床治愈、顯效、有效及無(wú)效。

總有效率（%）=臨床治愈率+顯效率+有效率

1.6.5 不良反應(yīng) 記錄患者治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況，包括惡心嘔吐、頭痛、腹部不適等。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群水平治療后兩組患者外周血Th17細(xì)胞和Th17/Treg比值較治療前降低（P＜0.05），觀察組降低更明顯（P＜0.05）；Treg 細(xì)胞升高（P＜0.05），觀察組升高更明顯（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者治療前后外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群水平比較（）

表1 兩組患者治療前后外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群水平比較（）

注：*表示與治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

2.2 血清IL-6、IL-17 和TGF-β 水平治療后兩組患者IL-6和IL-17低于治療前（P＜0.05），觀察組低于對(duì)照組（P＜0.05）；TGF-β高于治療前（P＜0.05），觀察組高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者治療前后血清IL-6、IL-17和TGF-β 水平比較（）ng/L

表2 兩組患者治療前后血清IL-6、IL-17和TGF-β 水平比較（）ng/L

注：*表示與治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

2.3 心肌損傷標(biāo)志物水平治療后兩組患者心肌損傷標(biāo)志物（CKMB、cTnI、MYO）水平均較治療前降低，觀察組低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組患者治療前后心肌損傷標(biāo)志物水平比較（）μg/L

表3 兩組患者治療前后心肌損傷標(biāo)志物水平比較（）μg/L

注：*表示與治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

2.4 臨床療效觀察組總有效率為92.9%，高于對(duì)照組的82.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 兩組患者臨床療效比較［n（%）］

2.5 不良反應(yīng)發(fā)生情況治療期間，對(duì)照組出現(xiàn)惡心嘔吐1 例、頭痛1 例；觀察組出現(xiàn)惡心嘔吐1例、頭痛1例、腹部不適1例，兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

病毒性心肌炎是病毒感染引起的心肌非特異性炎癥性疾病，在心肌局部或彌漫性的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡及壞死。多數(shù)心肌炎預(yù)后較好，但少部分可發(fā)展為重癥心肌炎，若不及時(shí)救治可導(dǎo)致患者猝死。中醫(yī)認(rèn)為病毒性心肌炎屬“溫病”“胸痹”范疇，發(fā)病源于氣陰兩虛，治療強(qiáng)調(diào)益氣養(yǎng)陰，活血化瘀［7］。相關(guān)研究顯示，黃芪注射液可提高病毒性心肌炎患者臨床療效，但機(jī)制不清［8］。

研究顯示，病毒感染后，機(jī)體可通過(guò)固有免疫激活Toll 樣受體2，促進(jìn)外周血單核細(xì)胞分泌相關(guān)炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α），聚集于心肌局部形成炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫應(yīng)答作用［9］。除了固有免疫外，有研究顯示，Th17 細(xì)胞及其特異性分泌的IL-17 在病毒性心肌炎的免疫損傷和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，該類(lèi)患者體內(nèi)Th17 和IL-17水平升高［10］。Th17細(xì)胞作為一種輔助性T細(xì)胞亞群，特異性分泌IL-17，參與眾多炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［11］。有研究顯示，通過(guò)抑制Th17 細(xì)胞活化，可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)的激活與放大，對(duì)于改善炎癥性疾病的進(jìn)展發(fā)揮重要作用［12］。黃芪具有益氣固表、補(bǔ)脾實(shí)衛(wèi)、托瘡生肌等功效。本研究對(duì)病毒性心肌炎患者給予黃芪注射液治療，結(jié)果顯示，黃芪注射液可降低外周血Th17 細(xì)胞水平，升高Treg 細(xì)胞亞群水平，從而抑制下游炎性通路的級(jí)聯(lián)放大。Th17 細(xì)胞是一類(lèi)CD4+T 細(xì)胞亞群，可通過(guò)分泌相應(yīng)炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)促炎反應(yīng)。Treg 細(xì)胞是CD4+T 細(xì)胞亞群之一，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抑制過(guò)度免疫反應(yīng)引起的組織細(xì)胞損傷。近年來(lái)，相關(guān)研究顯示，Treg細(xì)胞與Th17 細(xì)胞在功能上相互拮抗，在生理上維持平衡狀態(tài)，保持機(jī)體免疫功能穩(wěn)定，而一旦機(jī)體遭遇病毒或細(xì)菌感染，可導(dǎo)致Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞亞群的平衡失調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大［13］。黃芪注射液降低病毒性心肌炎患者炎癥反應(yīng)的機(jī)制可能如下：1）抑制Th17 細(xì)胞活化，降低IL-17 水平，抑制下游炎性通路激活；2）促進(jìn)Treg細(xì)胞亞群升高，引起TGF-β水平增加，進(jìn)而抑制機(jī)體核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化，降低心肌細(xì)胞的損傷與凋亡。通過(guò)抑制炎癥的激活與放大，可進(jìn)一步減輕心肌損傷，給予黃芪注射液治療后心肌損傷標(biāo)志物（CKMB、cTnI 及MYO）水平較治療前降低。黃芪注射液可提高病毒性心肌炎臨床療效，同時(shí)不增加不良反應(yīng)的發(fā)生率。說(shuō)明黃芪注射液在提高臨床療效的同時(shí)，安全性較好。

綜上所述，黃芪注射液可改善病毒性心肌炎患者免疫功能，逆轉(zhuǎn)外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群失衡，降低機(jī)體炎性通路的激活與放大，進(jìn)一步減輕心肌細(xì)胞損傷，提高臨床療效。鑒于本研究入選樣本量偏少、隨訪時(shí)間短，今后需進(jìn)一步加大樣本量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間來(lái)觀察黃芪注射液對(duì)病毒性心肌炎患者外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群的影響。