響應(yīng)曲面法優(yōu)化小葉紅葉藤揮發(fā)油包合物的制備工藝及評價*

袁彩英，劉本濤，黃嘉詠，嚴振碩，謝長江，霍麗妮，陳 睿，2△

1 廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530001；2 廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院

小葉紅葉藤（Rourea microphylla）是牛栓藤科紅葉藤屬攀援灌木，主要分布在福建和廣西等地，其莖葉具有清熱解毒、消腫止痛等功效。其所特含的香氣使之成為廣西壯族人民喜愛的保健茶飲［1］。小葉紅葉藤主要含有蒽醌類、黃酮類、甾體、脂肪酸類、萜類及香豆素類等化學成分［2-3］。目前，對小葉紅葉藤的研究處于初步探索階段，本課題組已完成對小葉紅葉藤揮發(fā)油的化學成分分析及抗氧化活性的初步研究［1］。由于小葉紅葉藤揮發(fā)油的溶解性及穩(wěn)定性較差，因此，在探索其藥理活性時遇到了一定阻礙。

研究表明，很多揮發(fā)油類物質(zhì)具有抗腫瘤［4］、抗病毒和抗菌［5］、抗抑郁［6］、抗氧化［7］等功效。因其化學性質(zhì)不穩(wěn)定，水溶性欠佳，臨床應(yīng)用多為直接溶解噴灑或加入一定增溶劑以制備成各種制劑，但仍存在穩(wěn)定性欠佳，難以長時間保存等問題［8］。β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）是被制藥行業(yè)廣泛應(yīng)用的藥用輔料，其疏水空腔能通過主-客體的作用力對親脂性物質(zhì)實現(xiàn)包合，在掩蓋不良異味的同時能增加親脂性物質(zhì)的溶解性及穩(wěn)定性，從而提高生物利用度［9］。本實驗利用β-CD 制備小葉紅葉藤揮發(fā)油的包合物，與傳統(tǒng)正交實驗對比，運用響應(yīng)曲面法從統(tǒng)計學角度出發(fā)，能更有效地確定最佳包合條件，進而改善其揮發(fā)油的溶解性和穩(wěn)定性，提高生物利用度。本研究通過顯微鑒定法、薄層色譜法、紫外分光光度法及紅外光譜分析法對揮發(fā)油包合物進行鑒定，從而更直觀地觀察包合物的形成，評價包合物的包合效果，最終為小葉紅葉藤的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑小葉紅葉藤購于廣西德?？h，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為Rourea microphylla；無水乙醇（成都科隆化學品有限公司）；無水硫酸鈉（天津博迪化工股份有限公司）；溴化鉀、香草醛、β-CD（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 儀器98-1-C 型數(shù)字控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；BSA2245 型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市舒美超聲儀器有限公司）；2X15-3 型恒溫磁力攪拌器（上海思樂儀器有限公司）；UV-2600 型紫外分光光度計（島津儀器蘇州有限公司）；BX53 型熒光正置顯微鏡（日本OLYMPUS）；iS10型紅外光譜儀（美國NICOLET）。

1.3 方法

1.3.1 小葉紅葉藤揮發(fā)油提?。?0］稱取適量小葉紅葉藤干燥莖葉，剪碎，加入10 倍量純水浸泡1 h。根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2204揮發(fā)油測定法中的甲法，提取至揮發(fā)油油量不再增加，停止加熱后靜置1 h 以上并收集揮發(fā)油，加入適量無水硫酸鈉干燥，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 包合方法的選擇

1.3.2.1 飽和水溶液法 準確稱取β-CD 8.00 g置于圓底燒瓶中，加入10 倍量超純水，加熱使之成為飽和水溶液。轉(zhuǎn)移至恒溫攪拌器中，緩慢滴入1 mL 揮發(fā)油（揮發(fā)油和無水乙醇等比例混合），保持400 r/min，50 ℃反應(yīng)2 h。冷卻至室溫，于4 ℃下冷藏24 h，抽濾，用適量超純水（約30 mL，10 mL/次）洗滌包合物表面未包合的環(huán)糊精，40 ℃真空干燥至恒重［11-12］。

1.3.2.2 超聲法 準確稱取β-CD 8.00 g 置于圓底燒瓶中，加入10 倍量超純水，加熱使之成為飽和水溶液。轉(zhuǎn)移至超聲波清洗器上進行超聲，緩慢滴入1 mL 揮發(fā)油，50 ℃下超聲2 h，其余操作同“1.3.2.1”項下“冷卻至室溫”起。

1.3.2.3 研磨法 準確稱取β-CD 8.00 g 置于圓底燒瓶中，加入適當超純水，研磨成團狀，緩慢滴入1 mL 揮發(fā)油，研磨2 h，其余操作同“1.3.2.1”項下“冷卻至室溫”起。

1.3.2.4 包合效果評價指標及方法 包合物收率：準確稱量上述方法得到的包合物質(zhì)量，計算包合物收率。包合物收率（%）=包合物質(zhì)量/（環(huán)糊精質(zhì)量+揮發(fā)油質(zhì)量）×100%。

空白回收率測定：用移液槍精密量取1.000 mL揮發(fā)油，加入適量β-CD，同揮發(fā)油測定方法一致，讀取揮發(fā)油體積，計算空白回收率［13］。重復(fù)實驗3 次，取其平均值?？瞻谆厥章剩?）=收集的揮發(fā)油量/揮發(fā)油投入量×100%。

包合率的測定：精密稱取上述包合物適量，置于圓底燒瓶中，加入500 mL 超純水，連接揮發(fā)油提取器，置電熱套中加熱，保持微沸狀態(tài)至揮發(fā)油油量不再增加，讀取揮發(fā)油體積，計算揮發(fā)油包合率［13］。揮發(fā)油包合率（%）=包合物中揮發(fā)油量/（揮發(fā)油投入量×空白回收率）×100%。

1.3.3 包合條件的優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗 以小葉紅葉藤揮發(fā)油包合物收率及包合率為測定指標，計算綜合評分。綜合評分=（揮發(fā)油包合率/揮發(fā)油包合率最高值）×60+（包合物收率/包合物收率最高值）×40［14-15］。采用單因素試驗分別考察β-CD和小葉紅葉藤揮發(fā)油的投料比（6，8，10，12，14）、包合時間（1、2、3、4、5 h）、包合溫度（30、40、50、60、70 ℃）對揮發(fā)油包合物制備的影響。

1.3.3.2 響應(yīng)面法對包合條件的優(yōu)化設(shè)計 基于單因素試驗基礎(chǔ)，以揮發(fā)油包合率和包合物收率的綜合評分為考察指標，以投料比（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）為考察因素。根據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)曲面的設(shè)計原理，設(shè)置3 因素3 水平進行試驗，見表1。

表1 實驗因素水平

1.4 最佳包合工藝的驗證和表征

1.4.1 最優(yōu)工藝條件驗證 為驗證預(yù)測結(jié)果的準確性，驗證預(yù)測的最佳工藝條件，實驗重復(fù)3次，計算綜合評分，比較實測值和預(yù)測值，計算偏差值。偏差=（實測值-預(yù)測值）/預(yù)測值。

1.4.2 包合物表征 顯微鑒別法［16］：取β-CD（A）、β-CD 與揮發(fā)油的物理混合物（B）、包合物（C）適量，分別置于載玻片上，滴加少量純水，使其均勻分散，蓋好蓋玻片，顯微鏡下（×100）觀察形態(tài)。

薄層色譜法［17］（TLC）：適當修改文獻方法，稱取適量β-CD 于離心管中，加入1 mL 無水乙醇，超聲15 min，離心后取上清液，得樣品I；用移液槍準確移取100 μL小葉紅葉藤揮發(fā)油，用無水乙醇等比例稀釋，得樣品Ⅱ；取適量包合物置于揮發(fā)油提取器中，重新提取包合物中的揮發(fā)油，用樣品Ⅱ處理方法處理，得樣品Ⅲ；將小葉紅葉藤揮發(fā)油和β-CD進行物理混合，加入5 mL無水乙醇，與樣品I處理方式處理，得樣品Ⅳ；將包合物與樣品I 處理方法一致，得樣品Ⅴ。用毛細管分別吸取上述樣品溶液，在硅膠G 薄層板點樣，置于乙酸乙酯和石油醚按1∶4 的體積比展開，晾干后用5%香草醛硫酸溶液噴霧顯色，置于105 ℃干燥箱中烘干至顯色清晰。

紫外分光光度計法［18］（UV）：分別取適量β-CD、揮發(fā)油、揮發(fā)油和β-CD 物理混合物和包合物，加入5 mL 無水乙醇，得樣品Ⅰ～Ⅳ。采用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。

紅外光譜法［19］（IR）：將β-CD、揮發(fā)油和β-CD的物理混合物和包合物采用KBr壓片后分別作為樣品Ⅰ～Ⅲ；用移液槍量取小葉紅葉藤揮發(fā)油10 μL直接滴加在KBr壓片上作為樣品Ⅳ，采用溴化鉀壓片法測定各樣品在4 000～400 cm處的紅外吸收光譜。

1.5 統(tǒng)計學方法利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計實驗，以綜合評分進行回歸方程擬合及方差分析，判斷數(shù)據(jù)的差異是否具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 揮發(fā)油空白回收率揮發(fā)油的平均空白回收率為95%，其RSD 為1.82%。說明β-CD 對揮發(fā)油具有一定吸附能力，但影響較小。見表2。

表2 揮發(fā)油空白回收率

2.2 包合方法選擇結(jié)果顯示，飽和水溶液法、超聲法、研磨法的包合率分別為84.21%、73.68%、63.16%。表明飽和水溶液法和超聲法的包合效果較好。因飽和水溶液法操作簡單易行，故選擇此法作為包合方法。

2.3 單因素試驗通過測定揮發(fā)油包合率和包合物收率，計算綜合評分。

1）當投料比過低時，β-CD 不足以包合完全揮發(fā)油，導(dǎo)致包合效果低。隨著投料比的增高，包合效果增加。但當比例過高時β-CD 形成聚合物進而阻礙揮發(fā)油進入空腔內(nèi)，從而影響包合率和包合物收率。2）隨著包合溫度的升高，包和效果出現(xiàn)先增高后降低情況。在溫度適宜情況下，主客體分子間能形成穩(wěn)定包合物，過低溫度使分子運動遲緩，包合效果不佳，過高溫度可能導(dǎo)致分子運動加快，造成包合物脫包現(xiàn)象，且溫度過高，揮發(fā)油容易揮發(fā)，一定程度上造成損失。3）包合效果一定程度上隨著包合時間的增加而逐漸增大，揮發(fā)油作為客體分子，隨著反應(yīng)時間的延長進入到β-CD 的空腔內(nèi)以分子間氫鍵結(jié)合更緊密，最終形成包合物。當反應(yīng)時間達到一定時，其包合效果趨于穩(wěn)定。見圖1。

圖1 單因素試驗結(jié)果

為進一步考察最優(yōu)的包合工藝，選擇投料比為8、10、12 g/mL；包合溫度為40、50、60 ℃；包合時間為1、2、3 h進行響應(yīng)曲面實驗。

2.4 響應(yīng)曲面包合條件優(yōu)化響應(yīng)曲面法作為一種優(yōu)化生物過程的統(tǒng)計學試驗設(shè)計，可以幫助確定最佳水平范圍，減少試驗組數(shù)以減少成本［20-21］?；趩我蛩卦囼灲Y(jié)果，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計模型試驗方案進行響應(yīng)曲面試驗。利用Design-Expert8.0.6 軟件，進行多因素回歸擬合，建立二次項回歸模型方程，得到方程：綜合評分=94.30+3.76A+3.73B+0.45C+0.78AB-5.97AC+1.36BC-3A2-7.31B2-8.62C2。見表3。

表3 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及結(jié)果

二次回歸方程的方差分析結(jié)果顯示該模型對小葉紅葉藤會揮發(fā)油包合效果的影響極顯著，失擬項P=0.0548，R2=0.9613，C.V.%為2.82，RAdj2=0.9116，說明該模型擬合效果較好，試驗誤差較小，說明該回歸方程對真實值反映較好，該試驗具有較高的可信度及準確性。見表4。

表4 回歸模型方差分析

方差分析結(jié)果顯示，一次項中的B、C，二次項中B2、C2和交互項中AC 表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01）。說明投料比和包合溫度為影響包合效果的主要因素，包合時間對包合效果影響無統(tǒng)計學意義。響應(yīng)面曲面圖可直觀反映不同因素交互作用的影響，可見各因素對包合效果的影響程度為：物料比（A）＞包合溫度（B）＞包合時間（C）。見圖2。

圖2 兩兩因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)曲面圖

2.5 最佳包合工藝驗證按最佳工藝重復(fù)試驗3 次，綜合評分依次為95.20、96.46、96.67 分，平均綜合評分為96.11 分，響應(yīng)曲面預(yù)測的綜合評分為96.63 分，預(yù)測值偏差率為-1.48%、-0.18%、0.04%，證明該模型能較好反映各因素與評價指標的關(guān)系。

2.6 包合物表征

2.6.1 顯微鑒定法β-CD（A）、β-CD 與揮發(fā)油的物理混合物（B）和包合物（C）的顯微成像圖顯示：β-CD 為無色透明的塊狀顆粒，粒度邊緣清晰、體積較大。β-CD 與揮發(fā)油的物理混合物，可見部分揮發(fā)油附著在β-CD 上，使其整體透明度變低。包合物為不透明黑色團狀物質(zhì)，包合物中可見粒度小顆粒狀物質(zhì)，應(yīng)為未包合的β-CD碎片。包合前后物質(zhì)形態(tài)發(fā)生改變，表明包合物新物相形成。見圖3。

圖3 包合物表征電子顯微成像圖（×100）

2.6.2 薄層色譜法 樣品Ⅱ、樣品Ⅲ和樣品Ⅳ在近似位置出現(xiàn)了相同斑點，且Rf 值基本一致。樣品Ⅰ和樣品Ⅴ中沒有出現(xiàn)斑點，說明小葉紅葉藤揮發(fā)油包合物已形成，且無或極少量揮發(fā)油存在。樣品Ⅱ和樣品Ⅲ表明小葉紅葉藤包合前后揮發(fā)油的主要成分變化不大，包合效果較好。見圖4。

圖4 各樣品的薄層色譜圖

2.6.3 紫外分光光度計法 小葉紅葉藤揮發(fā)油（樣品Ⅱ）與物理混合物（樣品Ⅲ）的紫外吸收圖譜相似，而包合物（樣品Ⅳ）的紫外吸收與β-環(huán)糊精（樣品Ⅰ）相似，但與樣品Ⅱ、Ⅲ的紫外吸收明顯不同，在306 nm處的吸收被遮掩，在250～300 nm處的紫外吸收明顯減弱，表明小葉紅葉藤揮發(fā)油進入空腔內(nèi)，形成穩(wěn)定的包合物。見圖5。

圖5 各樣品的紫外分光光度圖譜

2.6.4 紅外光譜法 物理混合物與β-CD 的紅外吸收圖譜相似，但其在2295、2926、2870、1171 cm處有較強吸收峰，表現(xiàn)為揮發(fā)油相同的吸收峰，說明物理混合物紅外圖譜是β-CD 和揮發(fā)油圖譜的疊加。包合物與β-CD 的吸收峰較為相似，包合物中未見揮發(fā)油特征吸收峰，表明包合完成。各樣品的紅外吸收圖譜見圖6。

圖6 各樣品的紅外吸收圖譜

3 討論

本研究利用響應(yīng)曲面法建立了小葉紅葉藤揮發(fā)油包合物的二次多項回歸方程，方程擬合性較好。該方法在中藥成分如揮發(fā)油、多糖的提取［22-23］、藥物處方設(shè)計［24］、化工［25］、生物發(fā)酵［26］等多領(lǐng)域均有應(yīng)用。在考察的包合條件中發(fā)現(xiàn)，β-CD和揮發(fā)油的投料比和包合溫度對小葉紅葉藤揮發(fā)油包合物制備的影響較大，投料比和包合溫度具有極顯著交互作用。優(yōu)化后的最佳包合工藝為β-環(huán)糊精和揮發(fā)油投料比為11.88 g/mL，包合溫度為52.8 ℃，包合時間為1.72 h，綜合評分為96.53 分，包合物的預(yù)測值和理論值偏差較小，表明響應(yīng)曲面法設(shè)計結(jié)果在揮發(fā)油包合物制備工藝優(yōu)化中的重要作用。

通過對小葉紅葉藤揮發(fā)油包合物的表征，直觀反應(yīng)包合后的物質(zhì)狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，小葉紅葉藤揮發(fā)油和β-CD 包合物是一種新物相，并非直接物理混合后的結(jié)果。同時，通過飽和水溶液法制備的包合物，其原本的揮發(fā)油氣味被掩蓋，溶解度和穩(wěn)定性得到較大改善，方便了制劑成型。揮發(fā)油經(jīng)過包合后其釋放速度降低，可以用于制備緩釋劑型，延長作用時間，更好滿足實際用藥的需求。對制得小葉紅葉藤揮發(fā)油包合物仍需對其藥理活性以及揮發(fā)油包合前后活性的差異做進一步探討。