基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的藥理學作用機制*

賈壯壯，陳紅陽，袁 慶，趙 磊，殷孟蘭，徐 耀，王少峽，柴麗娟，胡利民

天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院/天津市中藥藥理學重點實驗室/方劑學教育部重點實驗室，天津301617

腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點［1］，嚴重影響人們的生活質(zhì)量，其病理機制復(fù)雜［2-4］，急性期涉及能量代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應(yīng)及細胞凋亡等作用；亞急性期病理變化趨于緩和，各種始發(fā)因素和繼發(fā)因素共同參與腦損傷的加重或修復(fù)；恢復(fù)期腦組織病理顯示出現(xiàn)大量新生血管和神經(jīng)修復(fù)。缺血性腦卒中屬中醫(yī)“中風”范疇，氣虛血瘀是其主要病機之一，西醫(yī)常規(guī)治療難以達到滿意效果，且受治療時間窗限制；中藥具有多組分、多靶點、多機制的作用優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于腦卒中的治療。

芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七、降香油組成，具有益氣通脈，活血止痛功效，常用于治療氣虛血瘀型心血管疾?。?-7］。芪參益氣滴丸所含化學成分復(fù)雜［8-9］，其對缺血性腦卒中的治療效果及機制尚未明確，現(xiàn)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學從分子水平揭示芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點、功能及信號通路，闡明其多組分-多靶點-多機制的系統(tǒng)作用理念，為后期藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 芪參益氣滴丸活性化合物篩選與數(shù)據(jù)庫構(gòu)建通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）對芪參益氣滴丸所含化合物進行查詢匯總，再通過ADME 模塊，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（Drug-likeness，DL）≥0.18、Caco-2 滲透性（Caco-2 permeability，Caco-2）≥-0.4、血腦屏障透過性（blood-brain barrier，BBB）≥-0.3、藥物半衰期（drug half-life，HL）≥4 h進行活性化合物篩選，構(gòu)建芪參益氣滴丸活性化合物數(shù)據(jù)庫。

1.2 潛在靶點預(yù)測及藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出的藥物靶點經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt（https：//www.uniprot.org/）檢索，剔除重復(fù)蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)化為基因靶點，從而獲得芪參益氣滴丸活性化合物的潛在基因靶點，通過Cytospase 3.7.1 構(gòu)建藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 疾病-靶點數(shù)據(jù)庫與藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)融合通過在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）（http：//www.omim.org/）與疾病相關(guān)的基因與突變位點數(shù)據(jù)庫DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）收集缺血性腦中風治療的相關(guān)靶點，構(gòu)建缺血性腦中風相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫。融合已經(jīng)構(gòu)建好的藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)與疾病-靶點數(shù)據(jù)庫，篩選出芪參益氣滴丸治療缺血性腦中風的潛在核心靶點。

1.4 潛在核心靶點之間蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析將芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點對應(yīng)的基因名稱輸入蛋白質(zhì)相互作用（PPI 網(wǎng)絡(luò)）數(shù)據(jù)庫STRING（https：//string-db.org/），建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI network），將各個潛在核心靶點之間互相作用可視化。

1.5 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）/維基代謝通路（Wikipathway）信號通路富集分析利用Cytospase軟件中Glue GO插件及cytoHubba插件進行Biological Process、Cellular Component、Molecular功能GO富集分析及KEGG/Wikipathway相關(guān)通路富集分析，綜合預(yù)測芪參益氣滴丸與缺血性腦卒中靶點的生物學作用及調(diào)控通路。

2 結(jié)果

2.1 芪參益氣滴丸活性化合物信息篩選芪參益氣滴丸所含化合物，剔除重復(fù)化合物與缺少靶點的化合物，最終得出68 個活性成分，其中黃芪10個、丹參35個、三七4個、降香19個，見表1。

表1 芪參益氣滴丸活性化合物信息（Top10）

2.2 藥物-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過分析68 個化合物，初步獲得766 個潛在靶點；刪除單味藥內(nèi)不同化合物的重復(fù)靶點，獲得黃芪對應(yīng)靶點71 個，丹參對應(yīng)靶點91 個，降香對應(yīng)靶點78 個，三七對應(yīng)靶點57 個；刪除4 味藥物的重復(fù)靶點后獲得芪參益氣滴丸對應(yīng)潛在治療靶點108個。見圖1。

圖1 芪參益氣滴丸藥物-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3 潛在核心靶點以“Ischemic Stroke”為關(guān)鍵詞在Online Mendelian Inheritance in Man數(shù)據(jù)庫及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中查詢?nèi)毖阅X卒中相關(guān)治療靶點393個，與芪參益氣滴丸對應(yīng)的108個潛在靶點進行比對，篩選出24 個靶點與芪參益氣滴丸108個潛在靶點重合。24個潛在靶點可能是芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點，見表2。

表2 芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點

2.4 潛在核心靶點PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫得到對應(yīng)靶點蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，包括24個節(jié)點、87條邊，平均度值為7.25。其中節(jié)點為靶點蛋白，邊為各蛋白之間互作關(guān)系，節(jié)點連接邊數(shù)越多代表其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。見圖2。

圖2 芪參益氣滴丸

2.5 GO 富集分析及KEGG/Wikipathway 通路富集分析芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點GO 功能富集分析結(jié)果顯示，主要涉及調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝過程、一氧化氮（nitric oxide，NO）生物合成過程、脂質(zhì)代謝、類固醇激素受體（steroid hormone receptor，SHR）活性、上皮細胞遷移、成纖維細胞增殖等，具體還可參與調(diào)節(jié)免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）合成、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）代謝過程、白細胞趨化性的正向調(diào)節(jié)、B 淋巴細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)、適應(yīng)性免疫應(yīng)答的正向調(diào)節(jié)、巨噬細胞分化及吞噬作用調(diào)節(jié)、神經(jīng)血管重塑及其他相關(guān)組織重塑的調(diào)控、血管內(nèi)皮細胞遷移、調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)平滑肌收縮功能、DNA復(fù)制的負調(diào)節(jié)、磷脂酶活性調(diào)節(jié)等多個生物過程、細胞組成、分子功能。見圖3。

圖3 芪參益氣滴丸潛在核心靶點GO功能富集分析

芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點通路富集分析顯示，主要涉及血管再生相關(guān)信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）信號通路、內(nèi)皮素（endothelin，ET）信號通路、核受體信號通路、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）信號通路、前列腺素信號通路、雌激素信號通路、葉酸代謝通路、花生四烯酸代謝通路、炎性細胞因子介導(dǎo)的信號通路等。見圖4。

圖4 芪參益氣滴丸潛在核心靶點KEGG/Wikipathway信號通路富集分析

3 討論

多組分、多靶點、多機制是中藥防治疾病的優(yōu)勢及特點，網(wǎng)絡(luò)藥理學利用大數(shù)據(jù)資源，建立“藥物-靶點-基因-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)預(yù)測藥物與疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，而中醫(yī)的整體觀念、辨證論治理論與網(wǎng)絡(luò)藥理學的系統(tǒng)分析高度一致，已被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)揭示中藥對疾病作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和效應(yīng)機制［10］。芪參益氣滴丸為益氣活血代表方藥，具有益氣通脈、活血止痛的功效，臨床用于治療氣虛血瘀型胸痹，而氣虛血瘀是心肌梗死和缺血性腦卒中的共同病機［11-13］，益氣活血法是缺血性腦卒中的重要治療思路，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，初步挖掘芪參益氣滴丸治療缺血性腦卒中的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)及治療機制。

通過構(gòu)建芪參益氣滴丸活性化學成分數(shù)據(jù)庫，共篩選出68個活性成分，其中黃芪10個，丹參35 個，三七4 個，降香19 個；通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，初步發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸68 個活性成分在防治缺血性腦卒中中主要作用于NR3C2、TNF、IL4、NOS3、MMP9、TGFB1、KDR、EDNRA、ESR2、PPARG、ADRA1A、LTA4H 等24 個潛在核心靶點；對潛在核心靶點進行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，潛在核心靶點可通過調(diào)節(jié)血管再生相關(guān)信號通路、OPN 信號通路、ET 信號通路、核受體信號通路、ACEI 信號通路、前列腺素信號通路、雌激素信號通路、葉酸代謝通路、花生四烯酸代謝通路、炎性細胞因子介導(dǎo)的信號通路等多個途徑，參與調(diào)節(jié)ROS代謝過程、NO生物合成過程、脂質(zhì)代謝、SHR 活性、上皮細胞遷移、成纖維細胞增殖、Ig合成、RNS 代謝、白細胞趨化性、B 淋巴細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、適應(yīng)性免疫應(yīng)答、巨噬細胞分化及吞噬作用調(diào)節(jié)、神經(jīng)血管重塑及其他相關(guān)組織重塑、血管內(nèi)皮細胞遷移、血壓調(diào)節(jié)、平滑肌收縮功能、DNA復(fù)制、磷脂酶活性調(diào)節(jié)等多個生物過程、細胞組成及分子功能。

在缺血性腦卒中急性期，巨噬細胞、淋巴細胞及中性粒細胞等炎性細胞持續(xù)釋放黏附因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)，進而介導(dǎo)了炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重腦缺血再灌注損傷［14］。炎性因子釋放而形成的“瀑布效應(yīng)”是重要的病理生理基礎(chǔ)［15］，其中，TNF家族重要成員腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)的激活與血栓形成和血管反應(yīng)密切相關(guān)，促使神經(jīng)細胞凋亡，加劇腦損傷。有研究表明［16］，芪參益氣滴丸可降低氣虛血瘀型缺血性腦卒中患者TNF-α、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎癥因子表達水平。氧代謝在腦缺血損傷及神經(jīng)退行性疾病中也發(fā)揮了重要作用，ROS主要由線粒體電子傳遞鏈中的復(fù)合體Ⅰ與Ⅲ產(chǎn)生［17］，通過多種信號通路參與調(diào)節(jié)腦缺血損傷后氧化應(yīng)激及細胞凋亡，而一些抗氧化酶，如SOD 可消除過量ROS，調(diào)節(jié)細胞氧化應(yīng)激；研究表明，芪參益氣滴丸及黃芪、丹參、三七組分可上調(diào)SOD和CAT的基因表達，降低氮氧化物（nitrogen oxide，NOX）水平，進而抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，改善細胞能量代謝，對腦組織發(fā)揮保護作用以防缺血損傷［18-20］。

ET 和NO 是收縮和舒張血管的一對血管活性物質(zhì)，在體內(nèi)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，ET/NO 失衡可促進血栓形成與動脈粥樣硬化，從而導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展，而NO 在腦缺血早期可通過舒張血管、抗血小板聚集等作用改善腦循環(huán)和腦缺血癥狀［21］。研究表明，芪參益滴丸可通過促進ET、NO 相對平衡進而調(diào)整心臟血管內(nèi)皮功能，發(fā)揮血管內(nèi)皮保護作用，為其通過調(diào)節(jié)ET及NO保護腦卒中后微血管以防損傷提供了依據(jù)［22］。

脂質(zhì)代謝也參與了腦缺血損傷的多個病理環(huán)節(jié)［23］，芪參益氣滴丸能夠下調(diào)血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)濃度，上調(diào)高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)表達，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善血脂異常。還可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達下調(diào)心臟成纖維細胞增殖，在心血管疾病治療和預(yù)后發(fā)揮良好作用［24］，為芪參益氣滴丸治療腦卒中提供了可能依據(jù)。

雌激素是重要的類固醇激素之一，可與ER 特異性結(jié)合，通過促進多種神經(jīng)遞質(zhì)合成、調(diào)節(jié)能量代謝、抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷［25］。黃芪可激活雌激素受體［26］；丹參的脂溶性成分丹參ⅡA 可與雌二醇(estradiol，E2)競爭核內(nèi)ER，從而發(fā)揮雌激素樣活性［27］；三七皂苷R1是三七的重要提取物之一，可通過雌激素受體調(diào)控ATF6/Akt 信號通路減輕腦缺血再灌注損傷［28］，以上研究為芪參益氣滴丸通過調(diào)節(jié)雌激素信號通路改善腦缺血損傷提供了可靠依據(jù)。

腦卒中恢復(fù)期病理變化趨于緩和，神經(jīng)血管再生機制對于促進腦組織修復(fù)、改善微循環(huán)及神經(jīng)功能障礙具有重要意義，修復(fù)過程中有OPN 的參與［29］。研究表明，黃芪、丹參、三七活性組分可通過上調(diào)VEGF、BDNF、SYN 等改善腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)血管重塑，提示神經(jīng)血管再生及骨橋蛋白相關(guān)信號通路可能是芪參益氣滴丸改善腦缺血損傷恢復(fù)的重要機制［30-32］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法系統(tǒng)分析了益氣活血代表方藥芪參益氣滴丸“多組分-多靶點-多機制”治療缺血性腦卒中的潛在靶點及機制，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學作為一種基于數(shù)據(jù)庫的虛擬模式，不能確切揭示藥物在生物體內(nèi)的作用機制及途經(jīng)，因此通過網(wǎng)絡(luò)藥理學所得結(jié)果尚需進一步驗證。