改性藍(lán)藻生物炭促進(jìn)生物電化學(xué)系統(tǒng)陰極氫自養(yǎng)反硝化過程研究

熊江磊，羅嘉豪，嚴(yán)群

1.中國(guó)電子系統(tǒng)工程第二建設(shè)有限公司

2.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院

含硝酸鹽廢水的過量排放和不當(dāng)處置可能導(dǎo)致出生缺陷、致畸性和發(fā)生突變等不良影響，故這類廢水的有效處理已受到廣泛關(guān)注[1]。與物理化學(xué)法或生物處理法等常規(guī)處理手段相比，利用生物電化學(xué)系統(tǒng)（BES）處理廢水對(duì)能耗及污泥處理的需求更低[2]。此外，與以硫、鐵及其化合物為底物的自養(yǎng)反硝化相比，以氫為電子供體時(shí)的氫自養(yǎng)反硝化過程終產(chǎn)物僅為氮?dú)夂退?，且無有害副產(chǎn)物，對(duì)環(huán)境更加友好[3]。據(jù)報(bào)道，變形菌門（Proteobacteria）中的陶厄氏菌屬（Thauera）和氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）等[4-5]屬于氫氧化型反硝化劑，且其大部分都屬于細(xì)菌。因此耦合氫自養(yǎng)反硝化的BES處理硝酸鹽的工藝更具研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

為了進(jìn)一步提升BES陰極反硝化的效率，已出現(xiàn)利用電子穿梭載體促進(jìn)陰極微生物間的電子傳遞過程的方法[6]。其中，生物炭材料因?yàn)槠湄S富的電活性官能團(tuán)及良好的生物相容性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、環(huán)境和能源領(lǐng)域[7]。由于生物炭具有醌-對(duì)苯二酚結(jié)構(gòu)以及與縮合芳香族結(jié)合的共軛π電子體系2種氧化還原活性結(jié)構(gòu)，因此可以促進(jìn)生物降解系統(tǒng)中微生物和污染物間的胞外電子傳遞（EET）[8]。此外，通過酸、堿等不同預(yù)處理方式，可以提高生物炭表面含氧官能團(tuán)的種類和豐度以及材料的比表面積，有利于提升生物炭的性能[9-10]。但目前利用生物炭促進(jìn)BES生物陰極的反硝化過程中的電子傳遞的研究尚不多見。

筆者利用太湖藍(lán)藻制備生物炭，并用酸和堿等不同預(yù)處理方式對(duì)其進(jìn)行改性。通過掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線能譜分析（EDS）和傅里葉紅外光譜（FTIR）等對(duì)生物炭的性質(zhì)進(jìn)行表征，將生物炭加入到BES反硝化陰極，通過測(cè)定硝氮和亞硝氮的濃度研究硝氮還原過程，并借助高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)各組BES陰極微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，探究氫自養(yǎng)反硝化過程中的電子傳遞機(jī)制，以期為藍(lán)藻生物炭促進(jìn)生物電化學(xué)系統(tǒng)反硝化脫氮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藍(lán)藻生物炭的制備和改性

從太湖（無錫市）收集新鮮藍(lán)藻并曬干，用去離子水清洗干凈后于105 ℃烘箱（博訊 GZX9146）中烘干3 h。將藍(lán)藻粉置于真空管式爐（BEQ BEF-1200C-PV）中熱解。熱解的溫度梯度為5 ℃/min，熱解最終溫度為400 ℃，熱解時(shí)間為2 h。收集熱解后的固體，記為ABC-400。

取ABC-400 5 g與同等質(zhì)量的分析純KOH固體混合，以溫度梯度為10 ℃/min升溫至800 ℃，并停留1.5 h，所得固體記為ABC-800K。取ABC-400 10 g于圓底燒瓶中，加入200 mL硝酸（分析純）溶液，于100 ℃水浴80 min。干燥后按上述方法同樣進(jìn)行熱解，所得產(chǎn)品記為ABC-800N。另取ABC-400 10 g，以溫度梯度為 10 ℃/min升溫至800 ℃，并停留1.5 h，所得產(chǎn)品記為ABC-800。

1.2 生物炭材料的表征

生物炭材料的表面形貌由場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日立 S-4800，日本）觀察，精度為 2 μm。利用全自動(dòng)比表面積儀（Micromeritics ASAP 2460，美國(guó)）對(duì)生物炭材料的孔徑分布、比表面積進(jìn)行分析。材料表面的官能團(tuán)由傅里葉紅外光譜儀（Thermo Nicolet IS10，美國(guó)）檢測(cè)，分析軟件為OMNIC（Nicolet，美國(guó)）。

1.3 BES反硝化試驗(yàn)

搭建雙室BES反應(yīng)器，陰、陽極室通過陽離子交換膜（躍進(jìn)CMI-7000S，中國(guó)）隔開，各室實(shí)際容積為480 mL。利用鈦絲將碳纖維材料固定成束，制作兩極室的碳刷。非生物陰極中不含微生物。生物陰極中，陽極微生物的馴化通過數(shù)據(jù)記錄儀（Keithley 2700，美國(guó)）記錄，當(dāng)陽極電位在-0.55 V保持24 h以上時(shí)視為馴化完成。陰極微生物馴化完成的標(biāo)志則是當(dāng)陰極電位在-0.63 V并保持24 h以上[11]。

設(shè)置2組非生物陰極反應(yīng)器，其中1組陰極添加0.5 g ABC-800，不添加生物炭材料的另外1組設(shè)為對(duì)照組，測(cè)定陰極9 d的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮濃度。根據(jù)非生物陰極的結(jié)果，進(jìn)行BES的生物陰極試驗(yàn)。在微生物馴化完成后，向試驗(yàn)組分別加入0.5 g ABC-800、ABC-800N和ABC-800K，并以加入的生物炭材料命名反應(yīng)器，探究不同生物炭對(duì)生物陰極反硝化效果的影響。每24 h從陰極室中部取5 mL水樣，依據(jù)《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》[12]測(cè)定硝氮和亞硝氮濃度。所有的測(cè)試至少進(jìn)行3次，取平均值。

1.4 高通量測(cè)序試驗(yàn)

陰極的電勢(shì)與脫氮效果穩(wěn)定之后，取各組反應(yīng)器陰極碳刷上的微生物進(jìn)行測(cè)序。試驗(yàn)前分上、中、下3處剪取約3 cm的樣品，并與陰極液共同置于EP管中，混合均勻。經(jīng)DNA提取后，以細(xì)菌的16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)為靶標(biāo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（ABI GeneAmp 9700，美國(guó)）。擴(kuò)增時(shí)的正向引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG），反向引物為 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。純化的擴(kuò)增子在Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)上測(cè)序，可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)等的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭材料的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 生物炭材料的表面形貌

ABC-800、ABC-800N和ABC-800K 3種生物炭材料的表面形貌如圖1所示。由圖1可知，ABC-800的表面較為平滑，偶見顆?；蚪Y(jié)晶，掃描區(qū)域未出現(xiàn)明顯孔狀結(jié)構(gòu)；生物炭ABC-800N孔洞呈現(xiàn)蠕蟲刻蝕狀，孔洞碳壁互相連通，孔隙結(jié)構(gòu)以微孔為主；而KOH改性后的ABC-800K材料表面為溝壑狀，孔洞穿插于碳壁中，孔隙率較大?？梢?，2種改性方式都可有效改善生物炭的表面形貌，增加材料表面的孔隙結(jié)構(gòu)。

3種藍(lán)藻生物炭表面N、O元素含量的分布如圖2、圖3所示。由圖2可知，3種藍(lán)藻生物炭材料中N元素（圖中紅色散點(diǎn)）的分布區(qū)域有較大差異，ABC-800N的N元素分布最為廣泛，即其表面含量最高；ABC-800K次之，而ABC-800的N元素含量最低。由圖3可知，O元素（圖中綠色散點(diǎn)）的分布情況與N元素較為相似，ABC-800N在O元素分布上仍表現(xiàn)出最高豐度，而ABC-800最低。通過對(duì)3種材料表面元素含量進(jìn)行分析（表1）可知，ABC-800N中N、O元素含量最高，這可能會(huì)使該材料擁有較好的電子傳遞性能。

圖 1 3種生物炭材料的表面形貌Fig.1 Surface morphology of the three biochar materials

圖 2 3種生物炭材料表面N元素含量分布Fig.2 Distribution of N element content on the surface of three biochar materials

圖 3 3種生物炭材料表面O元素含量分布Fig.3 Distribution of O element content on the surface of three biochar materials

表 1 3種生物炭材料表面元素含量Table 1 Surface element contents of the three biochar materials %

2.1.2 生物炭材料的孔隙結(jié)構(gòu)

3種生物炭的N2吸附-脫附曲線、孔徑分布如圖4所示，其中圖4(b)縱坐標(biāo)dV/dW為孔徑的微分分布，表示孔容隨孔徑變化的關(guān)系。由圖4(a)可知，2種改性藍(lán)藻生物炭的吸附曲線為Ⅰ型曲線，說明孔內(nèi)的吸附勢(shì)較強(qiáng)，材料改性后微孔數(shù)量增多。中壓區(qū)出現(xiàn)滯后環(huán)，表明改性材料中具有一定數(shù)量的中孔[13]。由圖4(b)可知，未經(jīng)改性的ABC-800平均孔徑較大，孔容較??；而改性的平均孔徑顯著減小，孔容增加，說明對(duì)藍(lán)藻生物炭的改性可以有效改善材料表面的孔隙結(jié)構(gòu)。此外，ABC-800、ABC-800N、ABC-800K的比表面積分別為1.65、1 040.04和1 731.58 m2/g，表明2種改性方式可以極大地提升藍(lán)藻生物炭的比表面積。

圖 4 3種生物炭的N2吸附-脫附曲線和孔徑分布Fig.4 Nitrogen adsorption-desorption isotherms and pore width distribution of the three materials

2.1.3 生物炭表面的官能團(tuán)組成

由圖5可見，3種生物炭的FTIR譜圖較為相似，其中在3 425 cm-1處出現(xiàn)的寬帶峰，是由于醇、酚羥基或羧基中—OH的伸縮振動(dòng)引起的；而2 925 cm-1處的吸收峰多數(shù)為脂肪烴中C—H的伸縮振動(dòng)所引起[14]。在1 600 cm-1處有明顯的吸收峰，應(yīng)歸因于芳香族中C=C結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)，以及共軛醌或酮上存在的C=O結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)[15]。而1 389 cm-1處的吸收峰，則與羧基或苯酚中的—OH結(jié)構(gòu)的彎曲振動(dòng)相關(guān)[16]。在750 cm-1處出現(xiàn)了1個(gè)小的吸收峰，可能是高溫?zé)峤膺^程中產(chǎn)生的吡啶結(jié)構(gòu)所引起的環(huán)振動(dòng)[17]。因此，藍(lán)藻生物炭及其改性材料擁有豐富的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)。由于共軛醌、酮結(jié)構(gòu)是良好的電子傳遞結(jié)構(gòu)，既可接受電子也可釋放電子；而ABC-800N芳香類結(jié)構(gòu)C=O官能團(tuán)所對(duì)應(yīng)的吸收峰強(qiáng)度(1 600 cm-1)大于ABC-800及ABC-800K，因此在生物相容性和電子傳遞能力方面，ABC-800N可能優(yōu)于ABC-800及ABC-800K。

2.2 生物炭對(duì)BES脫氮的影響

2.2.1 對(duì)非生物陰極脫氮的影響

2組非生物陰極BES反應(yīng)器硝氮、亞硝氮濃度隨時(shí)間的變化如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)各陰極初始硝態(tài)氮濃度為100 mg/L時(shí)，由于添加生物炭材料的作用，從第1天起各非生物陰極反應(yīng)器中硝氮濃度呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。第9天時(shí)對(duì)照組陰極室內(nèi)硝氮濃度為79.66 mg/L，而加入ABC-800的BES組反應(yīng)器陰極硝氮濃度僅為60.52 mg/L，較對(duì)照組硝氮脫除率提高112.49%。這表明ABC-800的加入使得BES陰極硝氮的脫除效率提高，其機(jī)理為陽極產(chǎn)生的電子經(jīng)由外部的導(dǎo)線傳遞到陰極后，經(jīng)過陰極電極后被溶液中的硝酸鹽利用，從而進(jìn)行還原脫氮，但各反應(yīng)器中亞硝氮濃度呈現(xiàn)積累的趨勢(shì)。對(duì)照組的9 d亞硝氮積累濃度遠(yuǎn)高于ABC-800組，在第9天時(shí)達(dá)5.86 mg/L，而ABC-800組僅為1.68 mg/L。這可能是因?yàn)閬喯醯y以接受來自電極上的電子，而ABC-800作為電子穿梭載體，其本身可能會(huì)促進(jìn)亞硝氮的還原。

圖 5 不同生物炭材料的FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectra of different biochar materials

圖 6 2 組非生物陰極硝氮、亞硝氮濃度隨時(shí)間的變化Fig.6 Variation of nitrate and nitrite concentrations with time in two groups of abiotic cathodes

2.2.2 對(duì)生物陰極脫氮的影響

各組BES陰極室內(nèi)硝氮和亞硝氮濃度變化如圖7所示。由圖7可知，加入3種生物炭后生物陰極中硝氮的濃度均有所下降，其中ABC-800N組和ABC-800K組效果較好，第7天時(shí)硝氮濃度分別為5.45和50.75 mg/L，而ABC-800組次之，硝氮濃度為72.06 mg/L；對(duì)照組硝氮濃度最高，為99.44 mg/L。4組反應(yīng)器7 d脫氮效率分別為29.6%（對(duì)照組）、46.5%（ABC-800）、96.0%（ABC-800N）和 62.5%（ABC-800K）。這說明加入生物炭后BES陰極的硝氮去除效率明顯提升，且ABC-800N的效果最好。其原因可能是改性后藍(lán)藻生物炭表面含有豐富的含氧官能團(tuán)，且ABC-800N含有較多的與生物相容性及電子傳遞能力相關(guān)的芳香性含氧功能基團(tuán)。但各反應(yīng)器中亞硝氮濃度的變化表現(xiàn)出一定的差異：對(duì)照組和ABC-800組亞硝氮濃度呈上升趨勢(shì)，而ABC-800N和ABC-800K組則先上升后下降（圖7）。其中，第3天ABC-800N組達(dá)到峰值（1.26 mg/L），而ABC-800K則為5.36（mg/L）；第7天亞硝氮濃度分別為12.06（對(duì)照組）、7.21（ABC-800）、0.27（ABC-800N）和2.66（ABC-800K）mg/L，表明對(duì)照組和 ABC-800組中均有一定程度的亞硝氮積累，而ABC-800N和ABC-800K組中亞硝氮的脫除效率更高。

圖 7 投加3種生物炭材料后生物陰極硝氮、亞硝氮濃度隨時(shí)間的變化Fig.7 Variation of nitrate and nitrite concentrations with time in biological cathode under the addition of three biochar materials

2.3 高通量測(cè)序分析

2.3.1 門水平上微生物種群分布

投加不同生物炭材料時(shí)共有OTU在門水平的相對(duì)豐度如表2所示。由表2可知，加入改性藍(lán)藻生物炭后，BES陰極微生物群落在門水平上顯示出較大的差異性。4個(gè)試驗(yàn)組相對(duì)豐度占比較高的有變形菌門（Proteobacteria，均值＞30%）、擬桿菌門（Bacteroidota，均值＞12%）以及綠彎菌門（Chloroflexi，均值＞8%）。其中，對(duì)照組中的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門（相對(duì)豐度占比為52.15%）和擬桿菌門（12.91%），而加入生物炭后，變形菌門的相對(duì)豐度有所下降，分別為37.63%（ABC-800）、30.96%（ABC-800N）和36.02%（ABC-800K）；同時(shí)擬桿菌門的含量有所上升，達(dá)27.49%（ABC-800）、28.88%（ABC-800N）和21.89%（ABC-800K）。此外，相較于對(duì)照組，加入生物炭后BES陰極中放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對(duì)豐度也有所上升， ABC-800N組的相對(duì)豐度幾乎是對(duì)照組的20倍。因此，在加入生物炭后，氫自養(yǎng)反硝化BES的陰極微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化。原因是生物炭的加入可以改變陰極表面的比表面積與孔徑分布，此外不同的改性方式會(huì)導(dǎo)致陰極表面的官能團(tuán)以及N、O元素含量發(fā)生不同程度變化，從而可以不同程度改變微生物的群落分布。

表 2 投加不同生物炭材料后各組反應(yīng)器微生物的共有OTU在門水平的相對(duì)豐度Table 2 Relative abundance of shared OTU of microorganisms in each reactor at phylum level after different biochar materials addition %

2.3.2 屬水平上微生物的群落差異

各組反應(yīng)器中除了有其特有的微生物種群外，共有的微生物菌屬的相對(duì)豐度也有較大差異。因此通過橫向比較各反應(yīng)器中同一微生物的相對(duì)豐度可以判斷加入生物炭后微生物結(jié)構(gòu)的變化(圖8)。與對(duì)照組相比，加入藍(lán)藻生物炭后BES陰極的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，其中ABC-800N組的陶厄氏菌屬（Thauera）、JGI_0001001_H03以及Thiobacillus等屬的相對(duì)豐度明顯提升。Thauera是一種典型的氫自養(yǎng)反硝化細(xì)菌，已證實(shí)存在于在多種氫營(yíng)養(yǎng)型反應(yīng)器中，并與種間電子的直接傳遞過程（DIET）相關(guān)[18]；JGI_0001001_H03屬細(xì)菌目前較少見于文獻(xiàn)報(bào)道中，Yao等[19]在其反硝化效率較好的CW-C組反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌大量富集，表明其與反硝化過程相關(guān)；Thiobacillus也是一種常見的自養(yǎng)反硝化菌，它可以利用電極上的電子作為電子供體進(jìn)行硝氮的還原，并且與N2O的產(chǎn)生相關(guān)[20]。ABC-800組中豐度較高的種屬為PHOS-HE36，其是一種典型的反硝化劑[21]。ABC-800K 組中，Thermomonas及Chitinophagaceae的豐度較高。Bacteroidetes_VC2.1_Bac22見諸于硫酸鹽還原環(huán)境中，表明其有可能參與了硫酸鹽的還原[22]；而Thermomonas則是一種效果很好的反硝化劑[23]；Chitinophagaceae是一種氨氧化細(xì)菌[24]。這表明ABC-800K組微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同的改變，出現(xiàn)了其他的代謝機(jī)制。

圖 8 添加不同生物炭材料時(shí)反應(yīng)器內(nèi)微生物種群相對(duì)豐度Fig.8 Relative abundance of microbial population in reactors with different biochar materials addition

3 結(jié)論

（1）經(jīng)硝酸改性后的生物炭（ABC-800N）增加了材料本身的比表面積，且其表面含有較多的與生物相容性及電子傳遞能力相關(guān)的芳香性含氧官能團(tuán)。

（2）將ABC-800N投加到BES生物陰極后，其脫氮效率相較對(duì)照組明顯提高。

（3）生物陰極高通量測(cè)序結(jié)果表明，在門和屬水平上，各組反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)菌屬都包含電活性、產(chǎn)氫和反硝化相關(guān)的微生物群落；投加ABC-800N可以促進(jìn)BES反應(yīng)器中陰極的氫自養(yǎng)反硝化過程，緩解亞硝態(tài)氮的積累，同時(shí)提高了與氫自養(yǎng)反硝化及電子傳遞相關(guān)的微生物菌屬豐度。