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    FMO3調(diào)控犢牛原代肝細胞VLDL-TG的代謝

    2021-01-19 12:21:12鄧清華宋景旭張玉明劉國文
    飼料博覽 2020年8期
    關鍵詞:原代腺病毒犢牛

    鄧清華,宋景旭,張 焱,劉 婷,張玉明,劉國文,

    (1.內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術學院,內(nèi)蒙古 通遼 028000;2.吉林省松原市前郭縣醫(yī)院,吉林 松原 138000;3.吉林大學動物醫(yī)學學院,吉林 長春 130062)

    我國奶牛脂肪肝的發(fā)病率高于30%。脂肪肝影響奶牛的產(chǎn)奶量及乳品質(zhì),且常誘發(fā)皺胃變位、胎衣不下及生產(chǎn)癱瘓等圍產(chǎn)期的其他疾病,給奶牛業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[1]。圍產(chǎn)期奶牛的能量代謝特點是干物質(zhì)攝入減少而需求增加所導致的能量負平衡[2]。能量負平衡引發(fā)脂肪動員并引起血液中非酯化脂肪酸(Non-eserified fatty acid,NEFA)濃度增加[3]。NEFA 僅有20%能被乳腺組織吸收利用,其余大部分進入肝臟[4-5]。過多的NEFA 在肝臟中代謝生成甘油三酯(Triglyceride,TG),以極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)的形式轉(zhuǎn)運出肝臟,被外周組織利用[6]。NEFA增多不僅加強了促炎因子的活性,還加重胰島素抵抗,形成惡性循環(huán),最終加劇脂肪肝的發(fā)生[7]。由于反芻動物肝臟缺乏足量的脂蛋白脂酶和肝脂酶,通過水解氧化以清除TG的途徑受到明顯限制,VLDL 的分泌就成為肝臟清除TG 的主要途徑。當脂肪動員產(chǎn)生過量的NEFA 被酯化生成TG 而缺乏足夠多的VLDL 時,TG 就會積累在肝臟中而引發(fā)脂肪肝[8]。VLDL 的組裝與分泌主要由載脂蛋白B(Apolipopro?tein B,ApoB)100、載脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白(Microsome tri?glyceride transfer protein,MTTP)等蛋白的參與[9]。

    含黃素單加氧酶3(Flavin containing monooxy?genase 3,F(xiàn)MO3)作為肝臟中的一類微粒體酶,能參與外源性物質(zhì)的代謝,是動物肝臟中參與非營養(yǎng)物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)化的重要蛋白[10]。此外,F(xiàn)MO3可通過調(diào)節(jié)與肝臟脂肪生成和糖異生有關的多個基因來控制血脂的形成[11]。近年來,國外對于FMO3參與調(diào)控脂代謝研究較多。在敲除LDL 受體缺陷小鼠肝臟FMO3 基因后,可降低小鼠肝臟和血漿脂質(zhì)水平、膽汁酸的濃度以及肝臟TG分泌水平;而當PPARα被激活時,可通過其靶基因的反式激活增加FMO3的表達,促進脂肪酸氧化和糖異生[12]。研究表明,F(xiàn)MO3參與肝臟脂質(zhì)代謝的過程。因奶牛的代謝特征比較特殊,肝臟脂肪代謝的過程存在一定差異,目前尚無關于FMO3 與奶牛脂肪肝和對VLDL 組裝和分泌調(diào)節(jié)的相關文獻,所以對于FMO3在奶牛脂肪肝以及調(diào)節(jié)VLDL組裝和分泌方面的研究可為闡明疾病的發(fā)病機理及疾病的防治提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗動物

    1日齡健康荷斯坦犢牛。

    1.2 主要試劑

    Abcam 牛極低密度脂蛋白ELISA 測定試劑盒;Abcam 牛甘油三酯ELISA 測定試劑盒;天根2×TaqPCR Mastermix;碧云天細胞裂解液(PMSF);TaKaRa DL2000 DNA Marker和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒;Roche熒光定量試劑。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 肝細胞的分離與培養(yǎng)

    1日齡的禁食犢牛以無菌方法取出肝臟尾狀突。用兩步灌流法分離犢牛原代肝細胞[13]。將分離的肝細胞按每孔1×106個細胞放入6 孔細胞培養(yǎng)板,在37 ℃,5%CO2下進行培養(yǎng)。待細胞貼壁后更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)72 h后進行后續(xù)操作。

    1.3.2 腺病毒載體的構(gòu)建及感染肝細胞

    根據(jù)GenBank 中牛FMO3基因的編碼序列,設計篩選有效的shRNA 并且合成FMO3 基因全序列,構(gòu)建FMO3基因的低表達和過表達腺病毒并攜帶綠色熒光蛋白,培養(yǎng)HEK293細胞進行病毒包裝、擴增和純化,所得重組腺病毒測定其滴度,并達到109PFU·mL-1開始收集病毒。將體外培養(yǎng)的肝細胞貼壁培養(yǎng)72 h后用低表達、過表達和空腺病毒載體感染,設空白對照組(Control),低表達FMO3腺病毒載體組(LOW),過表達FMO3 組(OVER)和陰性對照組(NC,腺病毒空載體),每組6 個重復孔,病毒感染復數(shù)(MOI)設為100[5],繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細胞及上清液置于-80 ℃。

    1.3.3 實時熒光定量PCR

    細胞感染48 h 后用Trizol 收集細胞,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank 中牛的FMO3,ApoB100,MTTP,ApoE,β-actin基因序列,用Primer5軟件設計引物,引物序列見表1。用StepOnePlus 熒光定量PCR 檢測FMO3、ApoB100、ApoE和MTTP的mRNA相對表達量。

    表1 qRT-PCR相關引物

    1.3.4 VLDL和TG的收集與檢測

    VLDL 收集:細胞培養(yǎng)48 h后,將細胞培養(yǎng)液收集到無菌離心管中,1000 g離心20 min,取上清液,用于后續(xù)的測定。

    TG 提取:細胞培養(yǎng)48 h 后,用細胞刮收集于離心管中,按照碧云天細胞裂解液說明書加入細胞裂解液150 μL,待細胞充分裂解后14000 g離心5 min,取上清液用于檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細胞培養(yǎng)及感染腺病毒結(jié)果

    犢牛原代肝細胞分離培養(yǎng)72 h 后,狀態(tài)良好,適合感染腺病毒(見圖1A)。感染病毒后用熒光共聚焦顯微鏡觀察感染率,研究表明,當MOI=100時,感染效率>80%(見圖1B和1C)。

    圖1 犢牛原代肝細胞和重組腺病毒感染犢牛原代肝細胞熒光共聚焦結(jié)果(400×)

    2.2 FMO3、ApoB100、MTTP和ApoE基因的mRNA表達量

    犢牛原代肝細胞感染低表達、過表達和空載體48 h后用qRT-PCR檢測FMO3,ApoB100,ApoE和MTTP基因的mRNA 表達量結(jié)果見圖3A~D。其中,Control 為空白對照組,LOW 為低表達FMO3腺病毒組,OVER為過表達FMO3腺病毒組,NC為腺病毒空載體組,陰性對照。數(shù)值用“平均值±標準誤”表示(n=6),不同字母代表差異顯著(P<0.01);相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。

    圖2 犢牛原代肝細胞感染低表達、過表達和空載體48 h后用qRT-PCR檢測FMO3、ApoB100、ApoE和MTTP基因的mRNA表達量

    由圖2可知,當細胞感染FMO3 低表達腺病毒時,F(xiàn)MO3、ApoB100 和ApoE的mRNA 水平顯著降低(P<0.01),MTTP基因的表達量與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05);當細胞感染FMO3過表達腺病毒時,F(xiàn)MO3、ApoB100、ApoE和MTTP基因的mRNA 水平顯著增加(P<0.01),NC 組與Control組相比,各基因mRNA水平差異不顯著(P>0.05)。

    2.3 細胞上清VLDL和細胞內(nèi)TG濃度測定結(jié)果

    根據(jù)Abcam 牛VLDL 和TG ELISA 試劑盒檢測細胞上清VLDL 和細胞內(nèi)TG 的濃度。結(jié)果表明,F(xiàn)MO3 低表達組(LOW)VLDL 的濃度顯著低于空白對照組(P<0.01),高表達組(OVER)顯著高于空白對照組(P<0.01),陰性對照組(NC)也顯著高于空白對照組(P<0.01,見表2)。低表達組與空白對照組相比細胞內(nèi)TG 含量明顯降低(P<0.01),過表達組顯著高于空白對照組(P<0.01),陰性對照組與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05,見表3)。

    表2 各組VLDL濃度

    表3 細胞中甘油三酯濃度

    3 討 論

    脂肪肝是圍產(chǎn)期奶牛常見多發(fā)的營養(yǎng)代謝性疾病,是能量負平衡而導致的肝臟脂質(zhì)沉積,對奶牛養(yǎng)殖業(yè)的危害較大[14]。能量代謝主要在肝臟進行,肝臟參與脂質(zhì)代謝的多個重要環(huán)節(jié),包括脂肪酸的攝取與合成,脂質(zhì)的加工、貯存、氧化分解及輸出等[15]。FMO有多個基因型,基因產(chǎn)物多分布于肝組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[16]。人肝臟中含有3 種FMO,在成人肝臟至少有兩類FMO,其中最主要的是FMO3[17]。FMO3 是近年來發(fā)現(xiàn)的與脂代謝相關的調(diào)節(jié)因子[18]。牛的代謝特征與人和鼠的不同,且奶牛脂肪肝的發(fā)病率高于單胃動物,F(xiàn)MO3與牛的脂代謝是否有關系至今尚未見研究。

    VLDL 是肝細胞內(nèi)TG 運出外周組織的唯一因子。VLDL 主要在肝臟合成,其功能是將肝內(nèi)TG以VLDL 的形式從肝臟轉(zhuǎn)移至外周儲存利用[19]。當肝臟內(nèi)脂肪酸顯著升高時,肝臟VLDL輸出總量增加,但并不能減弱脂肪沉積。ApoB100、ApoE 是VLDL 的重要組成部分,ApoB100 是VLDL 中的TG結(jié)合部分,ApoE 是VLDL 由新生到成熟的重要蛋白[9]。有研究表明,過表達ApoE 能恢復小鼠原代肝細胞中VLDL-TG 的代謝,Patatin 樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域蛋白7(Patatin-like phospholipase domain contain?ing protein 7,PNPLA7)能通過與ApoE的相互作用調(diào)節(jié)ApoE 的穩(wěn)定性從而調(diào)節(jié)肝臟VLDL 的分泌。MTTP 是VLDL 合成過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白,主要功能是將肝細胞中游離的TG 轉(zhuǎn)移到VLDL 上,使TG 隨VLDL 的分泌排出[20]。廣藿香醇可通過增加ApoB100 的分泌和MTTP 的活性來恢復VLDL 的合成和輸出[21-22]。

    研究表明,在高脂血癥小鼠體內(nèi)過表達FMO3會增加肝臟和血漿中的脂質(zhì)[12]。本試驗中,F(xiàn)MO3低表達時ApoB100 和ApoE基因的mRNA 表達量顯著低于對照組,表明FMO3低表達會減弱ApoB100和ApoE基因的mRNA 表達水平,過表達FMO3 時ApoB100 和ApoE的mRNA 表達量則顯著升高。MTTP 在FMO3 低表達時與空白對照沒有顯著性差異,但是過表達FMO3 時則顯著升高。而VLDL和TG 在低表達FMO3 組顯著降低,過表達時顯著升高。這些結(jié)果說明了FMO3低表達時,通過抑制ApoB100和ApoE的表達,降低了VLDL的組裝與分泌以及TG 的合成;FMO3 過表達時,通過增加ApoB100、ApoE基因和MTTP的表達增加了VLDL的組裝與分泌及TG 的合成。研究表明,F(xiàn)MO3 過度表達時能增加肝細胞中TG 的沉積,在體內(nèi)可引發(fā)脂肪肝;而FMO3 低表達可降低肝細胞TG 的積聚,從而降低體內(nèi)TG 的含量,減少脂肪肝的發(fā)生,本研究為奶牛脂肪肝的發(fā)生機理和治療奠定理論基礎。

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