鄭州地區(qū)屠宰場牛羊肉中污染沙門菌的鑒定、毒力基因及耐藥性檢測

馬麗卿，張一鳴

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南 鄭州 450046)

沙門菌具有廣泛的宿主，可以引起多種動物和人的敗血癥、胃炎、流產(chǎn)等，是臨床中重要的人獸共患病原菌之一。該菌是畜產(chǎn)品污染中常見的食源性致病菌，可通過食物鏈傳染給人，對人和動物的危害較大。沙門菌廣泛分布于肉、蛋、奶、菜等食品中，肉類食品是沙門菌主要的傳播和暴發(fā)的載體。相關研究表明，屠宰場中屠宰的肉品、內(nèi)臟及胴體是污染沙氏菌的重要來源之一，該菌可以通過運輸中的動物和未煮熟的動物食品進行傳播，該菌危及人類公共安全問題。近幾年來關于肉類在屠宰加工過程中沙門菌污染報道逐漸增多，因而屠宰加工過程檢測沙門菌具有很重要意義。沙門菌攜帶毒力島、鞭毛、菌毛、質(zhì)粒和脂多糖等多種毒力基因，攜帶毒力基因在其致病過程中起著重要作用，且與致病性具有一定相關性?？咕幬锸桥R床中控制沙門菌感染有效的手段，由于抗生素的不合理使用導致多重耐藥性沙門菌菌株產(chǎn)生及食品殘留等問題，且對人們的健康存在潛在危害。

本試驗從鄭州地區(qū)屠宰場采集肉品樣品、胴體拭子、沖洗液等245份，采用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》方法進行沙門菌鑒定分析其污染情況，檢測沙門菌的毒力基因分布情況及耐藥情況，為進一步流行病學調(diào)查與防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2019年1月-2020年6月，從鄭州地區(qū)屠宰場采集牛羊肉樣品89份、胴體拭子94、沖洗廢水62份，共計245 份。

1.1.2 主要試劑 四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、緩沖蛋白胨水(BPW)、藥敏紙片，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門菌顯色培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術有限公司；沙門菌生化鑒定試紙條，購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司；DL2000 Maker、2×Master Mix，購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 分離與培養(yǎng) 采用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》的方法，將樣品處理后，接種于TTB增菌液中，220 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h，劃線接種于沙門菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于普通營養(yǎng)肉湯中純化培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 細菌生化鑒定 按說明書對疑似沙門菌菌株進行生化特性鑒定。

1.2.3 細菌PCR鑒定 參考文獻，根據(jù)GenBank中沙門菌的基因序列，設計鑒定引物invA：5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'，5'-TCTCGCACCGTCAAAGGAACC-3'，引物片段大小為249 bp。采用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用鑒定引物invA進行PCR鑒定，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術有限公司測序，測序結果與GenBank中登錄的參考株進行同源性比對。

1.2.4 毒力基因PCR檢測 參照文獻[10]，設計沙門菌14種基因，主要包括毒力質(zhì)?；?、、、、)，毒力島基因(、、、、)，其他毒力基因(、、、)，引物由上海生工生物技術有限公司合成，以1.2.3制備的菌株基因組DNA為模板，用梯度PCR法進行毒力基因檢測。

1.2.5 藥敏試驗 參照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行藥敏試驗，按照CLSI的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結果判斷，分析耐藥性。

2 結果與分析

2.1 分離培養(yǎng)結果

疑似沙門菌的菌株在沙門菌顯色培養(yǎng)基上長出大小一致、邊緣整齊的紫色菌落，革蘭染色鏡可見無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌；分離菌株用沙門菌生化鑒定試紙條鑒定，經(jīng)統(tǒng)計94株被鑒定為沙門菌。與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的沙門菌培養(yǎng)特性、形態(tài)學生基本一致。

2.2 細菌PCR鑒定結果

對生化試驗初步鑒定為沙門菌的菌株用引物invA對進行PCR鑒定，結果顯示94株分離菌株均擴增出大約為251 bp的目的條帶，與預期相符(圖1)，分菌株的PCR產(chǎn)物測序結果與GenBank中登錄的沙門菌的參考株同源性為97.9%～98.9%，說明分離的94株菌株從分子生物學方面鑒定為沙門菌。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結果

2.3 毒力基因檢測結果

用PCR法對分離的94株沙門菌分離株進行14種毒力基因檢測，結果顯示，分離的94株沙門菌分離株攜帶12種毒力基因，其中毒力基因、、、、、檢出率在45.7%～94.7%之間，毒力基因、、、、、檢出率在12.8%～43.6%之間，毒力基因、未檢出(表1)。

表1 毒力基因檢測結果

2.4 耐藥性分析結果

用K-B藥敏紙片法對分離的94株沙門菌株進行藥敏試驗，結果顯示，分離的94株沙門菌株對青霉素、阿莫西林、新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、強力霉素、多粘菌素、林可霉素、大觀霉素11種抗生素耐藥率在50%～97.9%之間，對頭孢曲松、頭孢噻呋、阿米卡星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星7種抗生素的耐藥率在14.9%～30.9%之間(表2)。

表2 藥敏試驗結果(陽性)

3 討 論

沙門菌是臨床中主要的食源性病原菌，該菌主要存在肉類食品中，尤其在屠宰加工過程中容易感染沙門菌，通過食物傳播，可導致人的急性食物中毒、腸炎、腹瀉等，嚴重可以導致死亡，該菌已經(jīng)危害到公共衛(wèi)生安全問題。近幾年來關于屠宰場及生產(chǎn)鏈中的沙門菌污染情況的報道越來越多。劉鮮鮮等報道從南寧市不同地區(qū)生豬屠宰場采集的300份樣品中分離的得到98株沙門菌。孫璐等報道山東雞肉屠宰環(huán)節(jié)中采集的樣品中分離得到239株沙門菌。劉英玉等報道在新疆地區(qū)定點屠宰場、農(nóng)貿(mào)市場采集牛羊胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品 841 份中分離得到47株沙門菌。本試驗研究表明，從鄭州地區(qū)屠宰場采集肉品樣品、胴體拭子、沖洗廢水等245 份中分離得到94株沙門菌。說明沙門菌在屠宰場中廣泛流行，應該引起重視，加強肉類衛(wèi)生檢疫制度。

沙門菌編碼基因的中攜帶多種毒力島和毒力基因，且致病性的沙門菌攜帶多種基因及毒力島呈現(xiàn)正相關，該菌主要定居于宿主的腸道內(nèi)，侵入宿主腸道的上皮組織細胞內(nèi)引起腸道病變，與該菌攜帶的毒力質(zhì)粒有關，沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)在其致病性起著關鍵作用。因此，沙門菌所攜帶的毒力基因在其致病過程起著重要作用。本試驗研究表明，分離的94株沙門菌分離株攜帶12種毒力基因，毒力基因、、、、、檢出率在45.7%～94.7%之間，其他毒力基因檢出率在12.8%～43.6%之間。說明分離的沙門菌攜帶多種毒力基因，分布比較廣泛，孫璐等、崔苗苗等報到的屠宰過程分離的沙門菌攜帶多種毒力基因一致。其作用機理有待進一步研究。

國內(nèi)許多研究表明沙門菌產(chǎn)生很強的耐藥性，其耐藥性產(chǎn)生與其攜帶的耐藥基因有關，還與抗生素使用有關，沙門菌的耐藥性可以通過食物在動物與人之間傳播，給人們的健康帶來潛在的威脅。本試驗研究表明，分離的94株沙門菌株對青霉素、阿莫西林、新霉素等11種抗生素耐藥率在50%～97.9%之間，對其他抗生素的耐藥率在14.9%～30.9%之間。說明從鄭州地區(qū)屠宰場牛羊肉中污染沙門菌菌株耐藥性嚴重。與張強等、劉英玉等、金宣辰等報道的存在一定差異，可能與地區(qū)、屠宰的動物有關，還與屠宰過程中的檢疫有關。

4 結 論

本研究分離得到94株沙門菌，攜帶12種毒力基因；分離的94株沙門菌株對青霉素、阿莫西林、新霉素等11種抗生素耐藥率為50%～97.9%，對其他抗生素的耐藥率為14.9%～30.9%，說明鄭州地區(qū)屠宰場牛羊肉中沙門菌污染嚴重，攜帶多種毒力基因，且耐藥性嚴重。