外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)與胰腺癌化療反應(yīng)及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

劉嬌 盧熹微 曹軍麗 鄭磊 徐紅梅

(秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤科，河北 秦皇島 066000)

近年來(lái)，全球胰腺癌發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，且患者5年生存率低至6%[1-2]?，F(xiàn)階段，臨床主要采取手術(shù)方式治療胰腺癌，但患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及死亡風(fēng)險(xiǎn)仍較高[3]。有報(bào)道稱，術(shù)后輔助化療能夠有效延長(zhǎng)胰腺癌患者生存時(shí)間[4]。故臨床已將手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后輔助化療方案作為胰腺癌標(biāo)準(zhǔn)療法，盡管予以術(shù)后輔助化療，依然有部分患者存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致預(yù)后不良[5]。以往研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells，CTCs)發(fā)生早期微轉(zhuǎn)移是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移重要環(huán)節(jié)[6]。CTCs主要指從原位腫瘤或繼發(fā)腫瘤病灶脫落之后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，其能通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)造成微轉(zhuǎn)移或者引發(fā)微小癌栓，在一定條件下能夠進(jìn)展為轉(zhuǎn)移癌。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注CTCs在腫瘤早期診斷、病情及預(yù)后評(píng)估中的檢測(cè)價(jià)值。相關(guān)研究稱，CTCs屬于腫瘤患者預(yù)后影響因素及靶向治療過(guò)程中重要標(biāo)志物[7]。隨著現(xiàn)代細(xì)胞檢測(cè)方式與鑒定技術(shù)不斷發(fā)展，通過(guò)外周血CTCs檢測(cè)進(jìn)行胰腺癌診斷、臨床療效評(píng)估與患者預(yù)后判定逐漸成為可能。當(dāng)前，關(guān)于外周血CTCs與胰腺癌化療反應(yīng)的研究較少。本文主要探究外周血CTCs與胰腺癌患者化療反應(yīng)及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，希望為臨床提供可靠指導(dǎo)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年2月～2019年10月我院收治的胰腺癌患者100例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確診為胰腺癌。②具有正常認(rèn)知，意識(shí)清晰。③對(duì)研究知情，簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①以往有胰腺癌手術(shù)、靶向治療或者放化療史。②其他部位惡性腫瘤患者。③合并自身免疫性疾病或者血液系統(tǒng)疾病。④發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時(shí)選取健康體檢者(體檢結(jié)果正常)與胰腺良性疾病患者各30例，其中胰腺良性疾病包括急性胰腺炎20例，慢性胰腺炎8例，胰腺囊腺瘤2例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法 胰腺癌患者均行手術(shù)切除(達(dá)到R0切除)與術(shù)后輔助化療，化療方案為：第1 d、第8 d、第15 d，采用靜脈滴注予以吉西他濱(國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H20030104，生產(chǎn)廠家：江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司)1000 mg/m2，每28 d治療是1周期。對(duì)患者隨訪1年，記錄生存情況。分別在患者術(shù)前與術(shù)后7 d(化療前)，抽取胰腺癌患者外周靜脈血7.5 mL，采取陰性富集聯(lián)合免疫熒光染色體原位雜交法(FISH)檢測(cè)CTCs，將富集后細(xì)胞均勻抹于玻片上，通過(guò)八號(hào)染色體擴(kuò)增探針以及白細(xì)胞表面抗原有效標(biāo)記CD45-A1exa594，然后行免疫熒光染色處理，于熒光顯微鏡下，采用雙免疫標(biāo)記法進(jìn)行富集細(xì)胞樣本的分析。CTCs陽(yáng)性判定[8]：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞核4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色陽(yáng)性，同時(shí)細(xì)胞核沒(méi)有重疊；無(wú)血源性白細(xì)胞上有抗原紅圈著色；單個(gè)細(xì)胞核里面8號(hào)染色體呈現(xiàn)異常擴(kuò)增現(xiàn)象，異常FISH信號(hào)點(diǎn)不少于3 個(gè)，且于40 倍鏡下發(fā)現(xiàn)信號(hào)不重疊?；熜Чu(píng)估參照影像學(xué)RECIST標(biāo)準(zhǔn)[9]，完全反應(yīng)(CR)：患者目標(biāo)病灶消失，維持時(shí)間≥4周；部分反應(yīng)(PR)：患者基線病灶長(zhǎng)徑和減短≥30%，維持時(shí)間≥4周；疾病穩(wěn)定(SD)：患者基線病灶長(zhǎng)徑和盡管有所變小，但沒(méi)有達(dá)到PR或變大未達(dá)PD；疾病進(jìn)展(PD)：患者基線病灶長(zhǎng)和變大≥20%或有新病灶產(chǎn)生。其中客觀緩解：PR+ CR；疾病控制：PR+ CR+SD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料表示為“頻數(shù)與頻率”，以2檢驗(yàn)；計(jì)量資料均經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，以表示，多組比較使用單因素方差分析法；生存分析使用Kaplan -Meier生存曲線；使用Logistic回歸模型分析腫瘤分期、分化程度與CTCs陽(yáng)性的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較 3組患者性別、年齡及體重指數(shù)(BMI)等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data of three groups

2.2 3組患者CTCs陽(yáng)性率比較 胰腺癌組CTCs陽(yáng)性率明顯高于良性疾病組與對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 3組患者CTCs陽(yáng)性率比較[n，n(×10-2)]Table 2 Comparison of CTCS positive rate among three groups

2.3 不同臨床特征患者CTCs陽(yáng)性率比較 不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CTCs陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化患者CTCs陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、高/中分化患者(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同臨床特征患者CTCs陽(yáng)性率比較[n，n(×10-2)]Table 3 Comparison of positive rates of CTCS in patients with different clinical features

2.4 腫瘤分期、分化程度與CTCs陽(yáng)性的關(guān)系 Logistic回歸分析顯示，胰腺癌患者腫瘤分期、分化程度與CTCs陽(yáng)性有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 腫瘤分期、分化程度與CTCs陽(yáng)性的關(guān)系Table 4 Relationship between CTCs positive and tumor stage and differentiation

2.5 不同化療療效患者術(shù)后CTCs陽(yáng)性率比較 術(shù)后CTCs陽(yáng)性37例，化療客觀緩解42例(42.00%)，疾病控制71例(71.00%)，疾病控制患者CTCs陽(yáng)性率明顯低于疾病進(jìn)展患者(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 不同化療療效患者術(shù)后CTCs陽(yáng)性率比較[n，n(×10-2)]Table 5 Comparison of postoperative CTCs positive rate in patients with different chemotherapy efficacy

2.6 患者預(yù)后情況 中位隨訪時(shí)間為9.87個(gè)月，術(shù)后CTCs陽(yáng)性患者生存9例(24.32%)，死亡28例(75.68%)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移30例(81.08%)；陰性患者生存26例(41.27%)，死亡37例(58.73%)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移42例(66.67%)；Kaplan -Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，CTCs陽(yáng)性患者1年生存率明顯低于CTCs陰性患者(2=5.114，P=0.024)，CTCs陽(yáng)性患者1年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率明顯高于CTCs陰性患者(2=4.479，P=0.034)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 總生存分析Figure 1 Total survival analysis figure

圖2 無(wú)進(jìn)展生存分析Figure 2 No progress survival analysis

3 討論

本研究顯示，胰腺癌組CTCs陽(yáng)性率較高于良性疾病組，明顯高于對(duì)照組，表明胰腺癌患者CTCs陽(yáng)性率呈異常升高趨勢(shì)。以往研究指出，CTCs檢測(cè)結(jié)果和腫瘤分化程度與患者預(yù)后存在密切相關(guān)性[10-11]。本研究經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者腫瘤分期、分化程度與CTCs陽(yáng)性有關(guān)，與上述研究結(jié)果基本一致，證實(shí)外周血CTCs陽(yáng)性表達(dá)影響因素主要為腫瘤發(fā)展至晚期、低分化，可能與CTCs繼承了相應(yīng)腫瘤干細(xì)胞較高侵襲性與轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胰腺癌患者外周血CTCs表達(dá)無(wú)關(guān)，分析原因可能是腫瘤病灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在其血運(yùn)行轉(zhuǎn)移原理上存在較大差異，后者主要通過(guò)人體淋巴系統(tǒng)管道而產(chǎn)生逐站以及跳躍式轉(zhuǎn)移，因此轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞能夠不經(jīng)血液循環(huán)系統(tǒng)。相關(guān)研究表明，腫瘤直徑與CTCs檢測(cè)結(jié)果存在顯著相關(guān)性，直徑越大，則其水平越高[12]。本研究則顯示腫瘤直徑與胰腺癌患者外周血CTCs無(wú)關(guān)，與上述研究觀點(diǎn)不一致，可能與本次研究樣本較少，存在一定局限性有關(guān)。

有研究指出，腫瘤患者CTCs里面Toll樣受體/髓樣分化因子88(TLRs/myd88)信號(hào)通路和其化療效果存在緊密聯(lián)系[13]。以往關(guān)于外周血CTCs表達(dá)與胰腺癌化療效果關(guān)系的研究少，此為本次研究創(chuàng)新性分析點(diǎn)。本研究中，疾病控制患者CTCs陽(yáng)性率明顯低于疾病進(jìn)展患者，提示CTCs陽(yáng)性患者術(shù)后輔助化療效果較差?？赡苡捎赥LRs能夠在CTCs中表達(dá)，而TLRs能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，加快腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，同時(shí)避免部分CTCs被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并且清除。有研究對(duì)胰腺癌手術(shù)患者進(jìn)行5年隨訪，發(fā)現(xiàn)其中位生存時(shí)間只有12～20個(gè)月[14-15]。本研究顯示，胰腺癌患者1年總體生存率35.00%，CTCs陽(yáng)性患者為24.32%，明顯低于陰性患者41.27%，表明胰腺癌術(shù)后生存率偏低，特別是CTCs陽(yáng)性患者。大部分胰腺癌患者臨床診斷時(shí)已發(fā)展至中晚期，并且病灶惡性程度高，因此相較于其他消化系統(tǒng)腫瘤，胰腺癌患者生存率更低[16]。有研究稱，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移為胰腺癌患者治療失敗主因[17]。以往有研究對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)治療前CTCs 顯示陰性的患者無(wú)進(jìn)展生存期與總生存期均優(yōu)于CTCs陽(yáng)性患者，且連續(xù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)CTCs數(shù)>5個(gè)者，具有較高復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[18]。本研究中，CTCs陽(yáng)性患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較CTCs陰性患者明顯更高，表明外周血陽(yáng)性與胰腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。還有研究稱，CTCs一般因腫瘤發(fā)展至晚期而被迫進(jìn)入相應(yīng)體循環(huán)，從而使外周血中可以檢測(cè)到CTCs，其為血液中微轉(zhuǎn)移主要方式，可以形成新轉(zhuǎn)移灶[19]?，F(xiàn)階段的研究表明，腫瘤遷移性一般是雙向的，人體多種癌細(xì)胞(包括黑色素瘤、乳腺癌以及結(jié)腸癌等)內(nèi)均有原位種植現(xiàn)象[20]?；蛟S原位種植現(xiàn)象可以解釋CTCs與胰腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。與傳統(tǒng)組織學(xué)以及影像學(xué)檢查相比，外周血CTCs檢測(cè)對(duì)人體近似無(wú)創(chuàng)，可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者腫瘤變化情況，方便進(jìn)行療效以及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移評(píng)估，從而為臨床治療提供可靠指導(dǎo)。

4 結(jié)論

綜上所述，胰腺癌患者腫瘤分期、病灶分化程度與外周血CTCs表達(dá)存在密切聯(lián)系，CTCs陽(yáng)性患者術(shù)后輔助化療反應(yīng)較差，更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或者死亡事件，臨床可通過(guò)其檢測(cè)有效評(píng)估患者病情、化療效果及預(yù)后。關(guān)于CTCs影響胰腺癌患者化療效果及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制，有待后續(xù)大樣本、多中心研究進(jìn)一步補(bǔ)充與完善。