基于體外鼠胚實(shí)驗(yàn)評(píng)估輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量*

特日格勒 愛倫高娃 格格恒 李秦宇琦 韓穎 馬成

(赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)是一項(xiàng)用于治療不孕不育的醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)，這種人類輔助生殖技術(shù)雖然已被廣泛應(yīng)用于不孕癥的治療，但受孕率仍不盡理想[1]。IVF實(shí)驗(yàn)室就像一座“加工廠”，直接影響IVF結(jié)局，胚胎質(zhì)量是判斷輔助生殖技術(shù)成功與否的重要因素，體外培養(yǎng)的胚胎失去母體的自身保護(hù)，在沒有任何保護(hù)屏障的情況下，對(duì)生存的微環(huán)境相當(dāng)敏感，極有可能影響其生長(zhǎng)發(fā)育潛能[2]。因此，在輔助生殖前，需要嚴(yán)格把控IVF實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量，全方位檢測(cè)各個(gè)環(huán)節(jié)，建立穩(wěn)定、可靠的培養(yǎng)體系，以確保為胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育提供相對(duì)穩(wěn)定的場(chǎng)所。目前，鼠胚實(shí)驗(yàn)是監(jiān)測(cè)IVF實(shí)驗(yàn)室各種培養(yǎng)液、實(shí)驗(yàn)耗材及實(shí)驗(yàn)設(shè)備質(zhì)量的常用生物方法[3]，本生殖中心于2019年初完成胚胎實(shí)驗(yàn)室建立，并對(duì)其進(jìn)行為期一個(gè)月的“熱處理”[4]，之后進(jìn)行雌鼠體內(nèi)外受精和胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估IVF實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量，旨在為臨床IVF-ET提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雌性昆明系小鼠30只6周齡，體重20～22 g，SPF級(jí)健康雄性昆明系小鼠8只8周齡，體重30～33 g，購自北京北科華夏生物醫(yī)藥科技有限公司，使用許可證號(hào)SYXK(京)2017-0044，室溫20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h晝夜交替。本研究獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 孕馬血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，hCG)購自杭州動(dòng)物藥品廠；卵裂液(CSC)、人輸卵管液(Human tubal fluid，HTF)以及HEPES緩沖的人輸卵管液(modified human tubal fluid，mHTF)購自歐文公司；人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)、洗精受精液、卵裂胚培養(yǎng)液G1和囊胚培養(yǎng)液G2購自瑞典Vitrolife公司；超凈工作臺(tái)購自美國(guó)Thermo公司；解剖顯微鏡購自日本Olympus公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國(guó)Bio-Rad公司；培養(yǎng)皿、試管等購自美國(guó)Falcon公司。

1.3 小鼠超排卵[5]用生理鹽水將PMSG和hCG配成100 U/mL的溶液存于-20℃待用，培養(yǎng)液在使用前一天配制后置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中過夜平衡。雌鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，48 h后腹腔注射hCG 10 U/只。

1.4 體外受精實(shí)驗(yàn)

1.4.1 采集卵母細(xì)胞[6]14只雌性小鼠腹腔注射hCG 16 h后，頸椎脫臼法處死，無菌環(huán)境下取出輸卵管，用胚胎處理液和10% HSA清洗3次，在體視鏡下用1 mL注射器刺破輸卵管膨大部位，使卵子團(tuán)釋放，收集后轉(zhuǎn)移至洗精受精液中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.2 采集精子并獲能 頸椎脫臼法處死雄鼠，無菌環(huán)境下取出附睪尾，用胚胎處理液和10% HSA清洗3次，用鑷子輕輕取出精子，收集后轉(zhuǎn)移至含有洗精受精液的試管中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中獲能30～60 min。

1.4.3 體外受精 收集獲能后的精子于一支新的試管中，取適量精子懸液加入至含有卵子團(tuán)的洗精受精液中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后，將卵子轉(zhuǎn)移到另一新的含有洗精受精液的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn) 剩余的16只雌性小鼠腹腔注射hCG后，將雌雄小鼠按照2∶1的比例合籠，第二天清晨將出現(xiàn)陰栓的雌鼠頸椎脫臼法處死，無菌環(huán)境下取出輸卵管，胚胎處理液和10% HSA清洗3次，在體視鏡下用1 mL注射器刺破輸卵管膨大部位，使合子釋放，收集后轉(zhuǎn)移至洗精受精液中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.6 原核及卵裂期胚胎觀察與培養(yǎng) 培養(yǎng)第0天下午顯微鏡下觀察原核合子形態(tài)；第一天上午觀察2細(xì)胞期胚胎，之后將2細(xì)胞期胚胎轉(zhuǎn)移至過夜平衡后的卵裂培養(yǎng)液中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；第二天上午觀察4細(xì)胞期胚胎，下午觀察8細(xì)胞期胚胎，并將8細(xì)胞期胚胎轉(zhuǎn)移至過夜平衡后的囊胚培養(yǎng)液中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；第三天上午觀察桑葚期胚胎；第四天觀察早期囊胚；第五天上午觀察囊胚。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間比較采用2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外受精結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行20個(gè)體外受精周期實(shí)驗(yàn)，共獲卵946枚，原核受精胚751個(gè)，受精率79.39%，2細(xì)胞數(shù)697枚，卵裂率92.80%，2細(xì)胞形成囊胚558個(gè)，囊胚形成率80.06%，見表1。

2.2 體內(nèi)受精結(jié)果 共進(jìn)行了14個(gè)體內(nèi)受精周期實(shí)驗(yàn)，共獲卵618枚，原核受精胚499個(gè)，受精率80.74%，2細(xì)胞數(shù)453個(gè)，卵裂率90.78%，2細(xì)胞形成囊胚368個(gè)，囊胚形成率81.24%，見表2。

2.3 兩組小鼠胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果 體內(nèi)受精組和體外受精組相比，受精率、卵裂率和囊胚形成率組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組小鼠胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果比較[n(×10-2)]Table 3 Comparison of in vitro culture results between the two groups of mouse embryos

2.4 小鼠胚胎形態(tài)觀察 顯微鏡下觀察不同發(fā)育階段的小鼠胚胎，見圖1。

圖1 體外受精后不同發(fā)育階段的小鼠胚胎(10×)Figure 1 Mouse embryos at different stages of development after in vitro fertilization

3 討論

人類輔助生殖技術(shù)是治療不孕不育的重要手段，其主要包括卵母細(xì)胞體外受精、胚胎早期體外培養(yǎng)和優(yōu)質(zhì)胚胎移植等過程[7]。但在IVF-ET過程中多個(gè)環(huán)節(jié)會(huì)影響胚胎質(zhì)量，導(dǎo)致妊娠率降低，例如超促排卵、采卵或采精過程以及配子或胚胎培養(yǎng)過程中所使用的器皿和試劑等因素[8]。因此，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量是輔助生殖技術(shù)成功的重要保障。由于小鼠胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)歷接近于人胚胎，因此鼠胚實(shí)驗(yàn)成為檢測(cè)人早期胚胎體外生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境的最佳模式，不僅能反應(yīng)胚胎的發(fā)育潛能，還能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)人員的操作技能[9-11]。本研究通過檢測(cè)體外鼠胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的卵裂率和囊胚率，從而對(duì)本院建立的生殖胚胎實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。

胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育受多種因素的影響，如溫度、濕度、CO2濃度以及離子濃度等都會(huì)影響受精卵和早期胚胎生存發(fā)育[12-13]。研究表明，注射hCG后隨受精時(shí)間的延長(zhǎng)，優(yōu)質(zhì)胚胎率呈增高趨勢(shì)[14]。生長(zhǎng)激素預(yù)處理可明顯提高卵巢低反應(yīng)患者體外受精的結(jié)局[15]。本研究結(jié)果表明，體內(nèi)獲得的原核受精胚發(fā)育狀況良好，體外獲得的原核受精胚同樣可發(fā)育至囊胚階段，受精率、卵裂率和2細(xì)胞囊胚形成率兩組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然各指標(biāo)偏低，但均符合人類輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本院輔助生殖實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)體系和技術(shù)員的操作水平已合格。通過對(duì)本研究中各周期的受精率和囊胚率分析，仍發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中多種因素影響胚胎形成和發(fā)育過程。從體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體外受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，不同周期受精率、卵裂率和囊胚形成率波動(dòng)較大，相對(duì)不穩(wěn)定，我們猜測(cè)可能是由于實(shí)驗(yàn)過程中，頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱，造成培養(yǎng)箱內(nèi)溫度變化大，且CO2濃度在一定時(shí)間段內(nèi)過低造成。研究表明，溫度降低不利于胚胎生存[16]。另一方面，可能由于技術(shù)人員操作技術(shù)不嫻熟，操作過程中培養(yǎng)皿離開溫度穩(wěn)定、飽和濕度的培養(yǎng)箱時(shí)間過長(zhǎng)，造成胚胎滲透壓改變，而滲透壓對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)定生長(zhǎng)至關(guān)重要[17]。此外，長(zhǎng)時(shí)間的觀察使胚胎體外曝光時(shí)間過長(zhǎng)，而研究發(fā)現(xiàn)，光照影響胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育[18]，通過不斷發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作人員技術(shù)不斷提高，受精率、卵裂率和囊胚形成率也在不斷升高，但是不同周齡的小鼠或處于不同發(fā)情期的小鼠、卵泡液中微生物的存在、體質(zhì)量等因素都是影響胚胎發(fā)育的關(guān)鍵，周齡較長(zhǎng)則會(huì)造成精子和卵子質(zhì)量下降，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[19-21]。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格把控實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)過程中所用到的試劑和儀器設(shè)置參數(shù)。

4 結(jié)論

鼠胚實(shí)驗(yàn)中多種因素影響受精率和囊胚形成率，因此不僅要嚴(yán)格控制影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境，還要不斷提高操作人員的技術(shù)水平，在鼠胚實(shí)驗(yàn)中任何細(xì)節(jié)都不容忽視，為建立具有合格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系和質(zhì)量保障系統(tǒng)提供一定的參考價(jià)值。但胚胎質(zhì)量受多種因素影響，如實(shí)驗(yàn)小鼠的品系、小鼠質(zhì)量以及小鼠周齡等，總之，輔助生殖實(shí)驗(yàn)室必須建立完整系統(tǒng)的質(zhì)量控制體系，以確保能夠安全穩(wěn)定運(yùn)行。