活血消異方對子宮內(nèi)膜異位大鼠內(nèi)膜容受性及CXCL12/CXCR4信號通路的作用機(jī)制*

趙秀萍 郝秀芳 朱秀娟

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMS)好發(fā)于育齡期婦女，是導(dǎo)致不孕的重要因素[1-2]。子宮內(nèi)膜異位癥本身和手術(shù)均會造成不排卵、不受精或著床失敗等，其主要因素是盆腔局部環(huán)境發(fā)生惡化，卵巢功能受到損傷及子宮內(nèi)膜容受性受到改變等。在臨床上子宮內(nèi)膜異位癥以性交疼痛、痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛為主要癥狀[3]。臨床上治療EMS采用腹腔鏡腹部手術(shù)和藥物治療為主，有很好的療效，可降低復(fù)發(fā)率，但在一定程度上對卵巢組織造成損傷，導(dǎo)致卵巢儲備降低，進(jìn)而對生育功能造成影響。在臨床上，治療EMS的費用相對較高，且術(shù)后恢復(fù)也相對較慢，如果術(shù)后使用激素抑制類藥物，不僅會耽誤患者的最佳生育時機(jī)，還會有復(fù)發(fā)的可能性，二次手術(shù)患者一般都難以接受[4]。目前學(xué)者對中藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的研究越來越深入，因此中藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的優(yōu)勢也逐漸顯現(xiàn)[5]。有學(xué)者研究證實，給予子宮內(nèi)膜異位癥患者活血消異方干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，不孕患者的妊娠率明顯是升高，且子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體外受精-胚胎移植率及活胎率也明顯提升，由此猜測活血消異方可能是通過對免疫平衡的調(diào)節(jié)，改善卵泡發(fā)育及子宮內(nèi)膜容受性來實現(xiàn)的[6]。CXC 趨化因子配體12(Chemokine C-X-C motif ligand 12，CXCL12)產(chǎn)生于基質(zhì)細(xì)胞，在胚胎發(fā)育過程中介導(dǎo)多種細(xì)胞的形成，例如B淋巴細(xì)胞、骨髓髓系細(xì)胞、神經(jīng)元等[7]。受體趨化因子CXC基序受體4(Chemokine C-X-C motif receptor 4，CXCR4) 是趨化因子CXCL12特異性受體，在機(jī)體中廣泛表達(dá)[8]，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)活性中，CXCL12及其受體CXCR4構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物軸學(xué)在其中起重要作用[9]，但CXCL12/CXCR4生物軸學(xué)在子宮內(nèi)膜異位癥中的具體表達(dá)研究較少。本研究旨在探究活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠子宮容受性及子宮內(nèi)CXCL12/CXCR4信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗共需雌性SD大鼠50只，性成熟且健康未孕，均從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買，合格證編號SCXK(京)2012-0001。大鼠體質(zhì)量為(200±20)g，SPF級，所有大鼠均飼養(yǎng)在動物房內(nèi)，保持室內(nèi)溫度恒定25℃，光照12 h一循環(huán)。所有大鼠均自由進(jìn)食攝水，適應(yīng)新環(huán)境7 d后進(jìn)行后續(xù)實驗。本研究通過醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 活血消異方湯劑由柴胡10 g，制香附10 g，丹參20 g，莪術(shù)10 g，皂角刺10 g等組成，將以上生藥加入10倍水量，煎煮3次，每次1 h，合并煎液，過濾濃縮至藥物濃度為1.8 g/mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房提供)；LIF、αvβ3抗體(深圳市豪帝華拓生物科技有限公司)；CXCL12、CXCR4抗體(美國R&D公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)；半定量 RT-PCR 試劑盒，Western-blot 試劑盒(美國TaKara公司)；苯甲酸雌二醇(寧波第二激素廠)；注射用青霉素鈉(華北制藥有限公司)；CXCR4拮抗劑AMD3100(美國Sigma公司)；小動物麻醉機(jī)(玉研儀器廠)；包埋機(jī)(孝感宏業(yè)醫(yī)用器械有限公司)；封片機(jī)、顯微鏡、切片機(jī)、透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司)。

1.3 動物分組和EMS大鼠模型制備[10]將實驗大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組10只，造模組(子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型組)40只。于造模前2 d肌肉注射苯甲酸雌二醇，使實驗大鼠處于同一動情期，連續(xù)1周每日定時做陰道涂片檢查，觀察大鼠動情周期，一般為4～5 d，實驗選擇動情周期正常的大鼠進(jìn)行。將造模組30只大鼠制備EMS大鼠模型，手術(shù)前先稱重大鼠后麻醉，置于超凈工作臺，腹部備皮，在尿道口上約1 cm處靠左側(cè)做平行于正中線長約1.5 cm的縱切口進(jìn)腹，游離大鼠左側(cè)子宮，近端離左子宮角1 cm處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢2 cm處結(jié)扎，并結(jié)扎兩端間的子宮系膜血管，切除約1 cm長子宮段立即放入盛有無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用眼科剪沿系膜部剪開管狀子宮，切割成3 mm2大小的子宮碎片，共4片，注意區(qū)分肌層與內(nèi)膜面，內(nèi)膜面朝向腸系膜，將右側(cè)腸系膜血管豐富處用線進(jìn)行縫合，檢查腹腔無出血后，腹腔留置青霉素鈉0.25 mL，再次縫合腹壁，逐層縫合皮膚關(guān)腹。分籠喂養(yǎng)，待所有大鼠自然蘇醒。手術(shù)后所有大鼠均肌肉注射青霉素鈉，連續(xù)3 d，每天1次，以預(yù)防術(shù)后感染。術(shù)后第二天肌肉注射苯甲酸雌二醇，以促進(jìn)異位灶的生長。假手術(shù)大鼠切除右側(cè)子宮后，在結(jié)腸系膜上用4-0可吸收線縫合4個線結(jié)，相鄰線結(jié)間距離約5 mm，余處理同前。

1.4 給藥干預(yù) 在制備模型過程中兩組大鼠均無死亡。造模后30 d再次開腹檢查，驗證造模是否成功。造模成功標(biāo)志是：當(dāng)移植病灶形成透明、半透明囊腫，表面有血管形成且移植物呈淡褐色時說明以為病灶內(nèi)有子宮內(nèi)膜生長。將造模成功的大鼠分為模型組(子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型組)、中藥組(子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型組給予活血消異方干預(yù)治療組)、西藥組(子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型組給予醋酸亮丙瑞林干預(yù)組)、拮抗劑組(子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型組給予AMD3100干預(yù)組)，每組10只。拮抗劑組：該組大鼠灌胃給予100 mg/mL AMD3100干預(yù) ；中藥組：所有大鼠均給予活血消異方灌胃，10 mL/kg，1天1次；西藥組：每只大鼠灌胃給予醋酸亮丙瑞林干預(yù)，0.04 mg/kg，1 d/次；假手術(shù)組和模型組大鼠均給予同體積的生理鹽水灌胃，1 d/次；所有大鼠均連續(xù)給藥7 d，后21 d按起始量的1/5維持。

1.5 取標(biāo)本采集 各組大鼠于停藥前5 d起每日上午9時行陰道脫落細(xì)胞學(xué)涂片觀察動情周期，停藥后擇動情期將大鼠以雌雄比例2∶1合籠。合籠次日起每日定時檢查雌鼠，如發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道脫落細(xì)胞涂片發(fā)現(xiàn)精子定位“孕鼠”，將當(dāng)日記為妊娠1 d，在妊娠第4 d進(jìn)行實驗標(biāo)本采集。2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠(35 mg/kg)，打開腹腔，將異位內(nèi)膜小心取出后放入標(biāo)記的包埋框，用中性福爾馬林溶液固定后用于實驗。取各組大鼠腹主動脈血3 mL，取血后迅速分離左側(cè)子宮，將子宮組織置于冰盤上，刮取內(nèi)膜組織裂解后用于蛋白質(zhì)印跡實驗檢測內(nèi)膜上LIF和αvβ3的表達(dá)及CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)。

1.6 ELISA檢測血清中E2、P水平 麻醉各組大鼠后分離大鼠左側(cè)頸總動脈，取5 mL動脈血后離心10 min，取上層血清置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用ELISA檢測血清中E2、P含量，實驗步驟均按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.7 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)觀察 與宮內(nèi)膜組織在10%的中性福爾馬林液固定36 h，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋切片后染色，組織切片厚度為4 μm，顯微鏡下觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜組織的病理學(xué)改變。

1.8 蛋白質(zhì)印跡檢測子宮內(nèi)膜LIF、αvβ3蛋白及CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá) 刮取各組大鼠子宮內(nèi)膜組織于EP管中，置于-80℃冰箱中保存。組織加入RIPA裂解液、PMSF與蛋白酶抑制劑混合的混合液，50 μL/100mg組織，提取總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜3 h，分別加入一抗LIF、αvβ3(1∶2000)，CXCL12、CXCR4(1∶2000)，4℃過夜孵育，室溫TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min，加入二抗羊抗兔IgG HRP(1∶2000)37℃ 1 h，漂洗PVDF膜，使用全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描PVDF膜成像后以各組目的蛋白條帶光密度值與內(nèi)參蛋白β-actin光密度值計算相對比值作為各組蛋白表達(dá)量。

1.9 qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜組織中CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá) 取各組大鼠子宮內(nèi)膜組織研磨后裂解，用TRIzol試劑提取總RNA，用分光光度法測定其含量和濃度miR-218檢測方法按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，檢測CXCL12、CXCR4及其下游MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平(內(nèi)參GAPDH)。反應(yīng)條件：3 min+94℃預(yù)熱；循環(huán)步驟30 s+94℃，30 s+60℃，45 s+72℃，共40個循環(huán)。72℃延伸10 min，用2-△△Ct法計算最后相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中E2、P水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中性激素指標(biāo)E2、P含量均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，西藥組和中藥組血清中性激素指標(biāo)E2、P含量均不同程度升高，且中藥組E2、P含量升高的較為顯著(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清中性激素指標(biāo)E2、P水平比較Table 2 Comparison of serum levels of sex hormone E2 and P in each group

2.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)比較 假手術(shù)組大鼠子宮壁結(jié)構(gòu)完整，子宮內(nèi)膜腺體密集，腺管增生、擴(kuò)張迂曲，上皮細(xì)胞呈高柱狀，管腔內(nèi)可見分泌，間質(zhì)細(xì)胞排列疏松；模型組大鼠子宮內(nèi)膜腺體稀少，腺腔較直并且狹小，血管數(shù)量減少；與模型組相比，西藥組和中藥組大鼠子宮內(nèi)膜組織均得到了明顯改善，間質(zhì)輕度疏松，血管輕度增生，且中藥組情況明顯好于西藥組，見圖1。

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)比較(HE染色，40×)Figure 1 Histopathological comparison of rat endometrium in each group

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜LIF、αvβ3蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠子宮內(nèi)膜中LIF、αvβ3蛋白表達(dá)明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；干預(yù)后的西藥組和中藥組中的LIF、αvβ3蛋白表達(dá)明顯升高，且中藥組升高較為顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜中LIF、αvβ3蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of LIF and αvβ3 protein in the endometrium of rats in each group注：A. 4組大鼠子宮內(nèi)膜中LIF、αvβ3蛋白表達(dá)；B. 4組大鼠子宮內(nèi)膜中LIF、αvβ3蛋白表達(dá)比較。與假手術(shù)組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05；與西藥組相比，③P<0.05

2.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)比較 模型組子宮內(nèi)膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白較假手術(shù)組表達(dá)明顯增多(P<0.05)；干預(yù)后的西藥組、中藥組和拮抗劑組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)均明顯低于模型組，中藥組和拮抗劑組大鼠CXCL12和CXCR4蛋白較西藥組降低的更為顯著(P<0.05)，說明活血消異方可抑制CXCL12和CXCR4蛋白的活性，與CXCR4抗結(jié)劑具有相似的作用機(jī)制，見圖3。

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)比較Figure 3 Comparison of CXCL12 and CXCR4 protein expression in rat endometrial tissues in each group注：A. 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)；B. 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)比較。與假手術(shù)組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05；與西藥組相比，③P<0.05

2.5 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組CXCL12(0.61±0.23)、CXCR4(0.21±0.11)、MMP-2(0.50±0.03)、MMP-9(0.50±0.02)相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12 (1.35±0.58)、CXCR4 (0.76±0.32)MMP-2(0.85±0.04)、MMP-9(0.98±0.05)表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，西藥組CXCL12(1.04±0.36)、CXCR4 (0.54±0.24)、MMP-2(0.76±0.03)、MMP-9(0.83±0.03)表達(dá)，中藥組CXCL12(0.85±0.38)、CXCR4 (0.42±0.26)、MMP-2(0.62±0.02)、MMP-9(0.65±0.02)表達(dá)，拮抗劑組CXCL12(0.80±0.36)、CXCR4(0.39±0.25)、MMP-2(0.65±0.02)、MMP-9(0.67±0.02)表達(dá)均顯著降低，且中藥組和拮抗劑組較西藥組降低的較為顯著(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12、CXCR4 、MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)比較Figure 4 Comparison of mRNA expressions of CXCL12, CXCR4, MMP-2 and MMP-9 in endometrial tissues of rats in each group注：A. 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中CXCL12、CXCR4 mRNA表達(dá)比較；B. 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)比較。與假手術(shù)組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05；與西藥組相比，③P<0.05

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，異位病灶的上皮和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)不但有雌孕激素受體的表達(dá)，而且還有合成甾體激素的芳香化酶，病灶組織不僅對體循環(huán)中的雌激素發(fā)生反應(yīng)，而且自身也能產(chǎn)生雌激素，形成局部高雌激素狀態(tài)，通過改變細(xì)胞因子分泌，黏附分子的表達(dá)等途徑促進(jìn)異位病灶的生長，和巨噬細(xì)胞相互作用，進(jìn)而對病灶的生長、增殖有一定促進(jìn)作用[11-12]。同時有研究發(fā)現(xiàn)EMS患者的在位及異位內(nèi)膜在體外孕酮作用下均表現(xiàn)為增長的趨勢，這與正常內(nèi)膜的反應(yīng)相反[13]。推測因孕激素受體表達(dá)方式改變而使孕激素的抑制和促分化作用減弱或消失，從而不能抑制異位灶的生長。因此探究EMS模型大鼠體內(nèi)雌孕激素在發(fā)病前后的變化對于研究EMS的病理本質(zhì)有重要的意義。

中醫(yī)范疇學(xué)中，把子宮內(nèi)膜異位癥歸為“痛經(jīng)”、“不孕”等，其中“血瘀”是中醫(yī)中公認(rèn)的子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制，也是導(dǎo)致其不孕的重要病理因素[14]。淤血占據(jù)血室，或逆流于胞宮之外或蘊結(jié)于腸膜脈絡(luò)肌肉之間，瘀血阻滯下焦少腹，影響沖任的正常功能，導(dǎo)致沖任功能發(fā)生失調(diào)，進(jìn)而會發(fā)生月經(jīng)失調(diào)、腹痛及攝精失敗等，治療多以活血化瘀為準(zhǔn)繩[15]。活血消異方重用丹參、赤芍、莪術(shù)以活血化瘀，散潔消癥，加用香附、柴胡等宣暢氣機(jī)、疏肝解郁之品，使氣行血暢，瘀血可除[16]。本研究結(jié)果顯示，活血消異方治療后大鼠血清中E2、P含量明顯升高，可見活血消異方對EMS大鼠體內(nèi)的性激素指標(biāo)有明顯的調(diào)節(jié)作用。

子宮內(nèi)膜容受性的改變及形成受多種不同的因素所調(diào)節(jié)。整合素是細(xì)胞表面的黏附分子，主要由α、β兩亞單位構(gòu)成，有粘附和信號傳遞兩大基本功能[17-18]。有研究顯示，子宮內(nèi)膜整合素αvβ3發(fā)生異常表達(dá)時會發(fā)現(xiàn)著床失敗，當(dāng)改善αvβ3的表達(dá)時會發(fā)現(xiàn)妊娠的結(jié)局也得到明顯改善。因此，整合素αvβ3作為子宮內(nèi)膜容受性建立的衡量標(biāo)志已被國內(nèi)外廣大學(xué)者認(rèn)可，其高表達(dá)對促進(jìn)受態(tài)子宮內(nèi)膜的建立具有重要意義。在判斷內(nèi)膜對胚泡是否有容受性及胚泡是否著床時，可根據(jù)著床窗口期 LIF 在子宮內(nèi)膜的表達(dá)來進(jìn)行判斷。本研究結(jié)果顯示，αvβ3和LIF蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠中表達(dá)降低，可見在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體內(nèi)αvβ3發(fā)生了異常的表達(dá)，LIF表達(dá)降低，說明大鼠子宮內(nèi)膜容受性也同時被降低，進(jìn)而降低了子宮內(nèi)膜對胚泡的容受性?；钛惙礁深A(yù)后發(fā)現(xiàn)αvβ3和LIF蛋白表達(dá)得到了明顯的回升，提示活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的子宮內(nèi)膜容受性有明顯的改善作用。通過對子宮內(nèi)膜異位癥小鼠給予活血消異方干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其對讓小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜著床因子整合素αvβ3和LIF的表達(dá)量顯著增加，進(jìn)而對EMS小鼠的子宮內(nèi)膜容受性進(jìn)行改善。

CXCL12/CXCR4是近年來研究較多的與腫瘤發(fā)病相關(guān)的因子，CXCL12會和CXCR4結(jié)合成為生物軸學(xué)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)活性，其也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及形成的先決條件[19-20]。子宮內(nèi)膜異位癥的生物學(xué)特性與惡性腫瘤極為相似。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs腫瘤)在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CXCR4、CXCL12相互作用可調(diào)節(jié)MMPs表達(dá)，且在癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮巨大作用[21-22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體內(nèi)CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯升高，活血消異方干預(yù)后的中藥組大鼠子宮內(nèi)膜中CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9表達(dá)得到了顯著的抑制，且中藥組與拮抗劑組大鼠CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平無顯著差異，均較低于西藥組，說明活血消異方可抑制CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9蛋白的活性，與CXCR4抗結(jié)劑具有相似的作用機(jī)制，推測活血消異方可通過抑制CXCL12/CXCR4信號，抑制MMP-2、MMP-9表達(dá)進(jìn)而改善子宮內(nèi)膜異位癥。姚燕婷等[23]研究證實，SDF-1、CXCR4可能通過參與子宮內(nèi)膜增殖，侵襲過程而導(dǎo)致不孕發(fā)生。

4 結(jié)論

活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠子宮內(nèi)膜容受性進(jìn)行有效的改善，同時可抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠CXCL12、CXCR4表達(dá)。