LncRNA FOXD3-AS1在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)SKOV3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響*

黃麗 龔豪 張春蓮 黃潤(rùn)強(qiáng) 任松森

(十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 1.婦科；2.腎病內(nèi)科，湖北 十堰 442000)

卵巢癌是最普遍的婦科惡性腫瘤之一，在全世界每年約有22.5萬(wàn)新診斷患者，估計(jì)有14萬(wàn)患者死亡[1-2]。由于卵巢癌早期癥狀不典型，篩查方法不可靠，大多數(shù)患者診斷時(shí)已為晚期，5年生存率僅15%～30%。因此深入研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制具有深遠(yuǎn)的意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, lncRNA)是一種長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA[3]，在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4-6]。既往研究表明，一些lncRNA在卵巢癌中存在異常調(diào)節(jié)，參與了卵巢癌的發(fā)展，如lncRNA TP73-AS1通過(guò)調(diào)控MMP2和MMP9促進(jìn)卵巢癌增殖和轉(zhuǎn)移[7]。LncRNA DANCR靶向miR-145促進(jìn)卵巢癌腫瘤生長(zhǎng)和血管生成[8]。研究還發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1可通過(guò)PI3K-AKT途徑促進(jìn)上皮性卵巢癌增殖和轉(zhuǎn)移[9]。以上研究均表明，lncRNA的異常表達(dá)與卵巢癌的惡性發(fā)展具有一定的聯(lián)系。近年有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXD3-AS1與乳腺癌的臨床進(jìn)展相關(guān)[10]。高表達(dá)的lncRNA FOXD3-AS1通過(guò)調(diào)控miR-127-3p/中介復(fù)合物亞基28軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展[11]。LncRNA FOXD3-AS1通過(guò)調(diào)控RICTOR介導(dǎo)AKT通路促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)和侵襲[12]。然而，LncRNA FOXD3-AS1在卵巢癌中的潛在分子機(jī)制尚不清楚。因此本研究旨在探討LncRNA FOXD3-AS1在卵巢癌中的表達(dá)模式、作用及潛在的功能機(jī)制，希望為卵巢癌的治療找到新的理論靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 收集2020年10月～2021年6月我院手術(shù)切除的卵巢癌組織及癌旁正常組織共55例。所有臨床標(biāo)本立即用液氮快速冷凍，-80℃保存至RNA分離。所有患者均被告知本研究并簽署知情同意書(shū)。本研究獲得了我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞系(SKOV3)和人正常卵巢上皮細(xì)胞系(IOSE80)取自美國(guó)典型菌株保藏中心(ATCC, Manassas, VA, USA)。所有細(xì)胞在添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco, Thermo Fisher Scientific)中培養(yǎng)，并在37℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 RNA分離和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 從卵巢癌組織和細(xì)胞系中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。引物由上海生物工程公司合成，引物序列見(jiàn)表1。real-time PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，按說(shuō)明書(shū)操作。擴(kuò)增反應(yīng)條件包括95℃預(yù)變性1 min, 95℃預(yù)變性15 s, 60℃預(yù)變性31 s, 45個(gè)循環(huán)，95℃預(yù)變性15 s, 60℃預(yù)變性15 s, 95℃預(yù)變性15 s。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3次。采用2-△△ct法計(jì)算LncRNA FOXD3-AS1，miR-325，CDCA5的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 專為FOXD3-AS1、CDCA5靶向的siRNA (si-FOXD3-AS1)、(si-CDCA5)、siRNA對(duì)照(si-control)、miR-325模擬物(miR-325 mimic)、模擬物對(duì)照(mimic control)、miR-325抑制劑(miR-325 inhibitor)、抑制劑對(duì)照(inhibitor control)均購(gòu)自中國(guó)廣州RiboBio公司。SKOV3細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，在轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)過(guò)夜。然后，LipofectamineTM2000 (Thermo Fisher Scientific)將質(zhì)粒將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)分析。

1.2.4 Western blot SKOV3細(xì)胞分為：①siRNA NC、FOXD3-AS1 siRNA、CDCA5 siRNA組。②inhibitor control、miR-325 inhibitor組。③pcDNA-3.1(+)+mimics control、pcDNA-FOXD3-AS1+mimics control、pcDNA-3.1(+)+miR-325 mimics、pcDNA-FOXD3-AS1+miR-325 mimics組，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。來(lái)自組織或細(xì)胞的蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中封閉2 h后，用抗E-cadherin、N-cadherin的特異性一抗在4℃下孵育過(guò)夜。然后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔第二抗體1∶5000檢測(cè)2 h。用化學(xué)發(fā)光法觀察抗原-抗體復(fù)合物。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 在pGL3質(zhì)粒(Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA)中合成FOXD3-AS1完整片段或其突變體，并將其克隆到螢火蟲(chóng)熒光素酶基因下游，命名為pGL3- FOXD3-AS1野生型(wt)和pGL3- FOXD3-AS1突變型(mut)。同樣，通過(guò)PCR擴(kuò)增CDCA5中含有預(yù)測(cè)的miR-325結(jié)合位點(diǎn)或突變位點(diǎn)的3′UTR，并插入pGL3質(zhì)粒，命名為pGL3-CDCA5- 3′UTR - wt和pGL3-CDCA5- 3′UTR - mut。轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞分為：①pGL3-FOXD3-AS1 wt+mimics control、pGL3-FOXD3-AS1 wt+mimics control+miR-325 mimics、pGL3-FOXD3-AS1 mut+mimics control+mimics control、pGL3-FOXD3-AS1 mut+mimics control+mimics control組。②pGL3-CDCA5 wt+mimics control、pGL3-CDCA5 wt+mimics control+miR-325 mimics、pGL3-CDCA5 mut+mimics control+mimics control、pGL3-CDCA5 mut+miR-325 mimics組。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染后48 h收獲細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(Promega Corporation)測(cè)定熒光素酶活性。以腎草熒光素酶活性為內(nèi)參，對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性進(jìn)行歸一化。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) SKOV3細(xì)胞分為：①siRNA NC、FOXD3-AS1 siRNA、CDCA5 siRNA組。②inhibitor control、miR-325 inhibitor組。③pcDNA-3.1(+)+mimics control、pcDNA-FOXD3-AS1+mimics control、pcDNA-3.1(+)+miR-325 mimics、pcDNA-FOXD3-AS1+miR-325 mimics組。轉(zhuǎn)染48 h后在12孔板中接種密度為1×105/cm2的SKOV3細(xì)胞。過(guò)夜培養(yǎng)后在皿中底部形成單層細(xì)胞，取200 μL高壓滅菌槍頭垂直于孔板進(jìn)行線性劃痕。劃線完成后使用無(wú)菌PBS清洗3次，去除劃下的細(xì)胞，更換新鮮無(wú)血清或低血清(<2%)的培養(yǎng)基。細(xì)胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，如0、48 h后取出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并拍照。使用 Image J 軟件打開(kāi)圖片后，隨機(jī)劃取6至8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。

1.2.7 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) SKOV3細(xì)胞分為：siRNA NC、FOXD3-AS1 siRNA、CDCA5 siRNA組；inhibitor control、miR-325 inhibitor組；pcDNA-3.1(+)+mimics control、pcDNA-FOXD3-AS1+mimics control、pcDNA-3.1(+)+miR-325 mimics、pcDNA-FOXD3-AS1+miR-325 mimics組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。將細(xì)胞懸液稀釋后接種在培養(yǎng)皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10 min，然后用流水緩慢洗去染色液，在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA FOXD3-AS1、miR-325和CDCA5在卵巢癌組織和細(xì)胞中的差異表達(dá) 與癌旁組織相比，卵巢癌組織中FOXD3-AS1相對(duì)基因表達(dá)上調(diào)(t=26.16，P<0.01)，CDCA5相對(duì)基因表達(dá)上調(diào)(t=27.03，P<0.01)，miR-325相對(duì)基因表達(dá)下調(diào)(t=25.43，P<0.01)；與IOSE80細(xì)胞相比，SKOV3細(xì)胞中FOXD3-AS1相對(duì)基因表達(dá)上調(diào)(t=22.68，P<0.01)，CDCA5相對(duì)基因表達(dá)上調(diào)(t=23.54，P<0.01)，miR-325相對(duì)基因表達(dá)下調(diào)(t=19.67，P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 LncRNA FOXD3-AS1組、miR-325組和CDCA5組在卵巢癌組織和細(xì)胞中的差異表達(dá)Table 2 Differential expression of LncRNA FoxD3-AS1, miR-325 and CDCA5 in ovarian cancer tissues and cells

2.2 敲減FOXD3-AS1表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMT 與siRNA NC組相比，F(xiàn)OXD3-AS1 siRNA組FOXD3-AS1基因相對(duì)表達(dá)顯著下調(diào)(t=28.93，P<0.01)；與siRNA NC組相比，F(xiàn)OXD3-AS1 siRNA組SKOV3細(xì)胞克隆數(shù)目顯著減少(t=8.06，P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值上調(diào)(t=18.45，P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值下調(diào)(t=19.82，P<0.01)，細(xì)胞劃痕愈合率降低(t=8.23，P<0.05)，結(jié)果說(shuō)明敲減FOXD3-AS1表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMT。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 敲減FOXD3-AS1表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMTFigure 1 Knockdown of FOXD3-AS1 expression inhibited SKOV3 cell proliferation, migration and EMT 注：A.RT-qPCR檢測(cè)FOXD3-AS1基因表達(dá)；B.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖；C.Western blot檢測(cè)SKOV30細(xì)胞EMT蛋白相對(duì)表達(dá)；D.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞遷移情況

表3 敲減FOXD3-AS1表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及Table 3 Knockdown of FOXD3-AS1 expression inhibited SKOV3 cell proliferation, migration and EMT

2.3 LncRNA FOXD3-AS1與miR-325的靶向關(guān)系 FOXD3-AS1和miR-325之間的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。pGL3-FOXD3-AS1 wt+miR-325 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性與pGL3-FOXD3-AS1 wt+mimics control組相比顯著下調(diào)(t=19.27，P<0.01)，pGL3-FOXD3-AS1 mut+miR-325 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性與pGL3-FOXD3-AS1 mut+mimics control組相比無(wú)顯著變化(t=0.68，P>0.05)，見(jiàn)表4。

圖2 lncRNA FOXD3-AS1與miR-325的靶向關(guān)系Figure 2 Targeting relationship between lncRNA FoxD3-AS1 and miR-325

表4 lncRNA FOXD3-AS1與miR-325的靶向關(guān)系Table 4 Targeting relationship between lncRNA FOXD3-AS1 and miR-325

2.4 下調(diào)miR-325促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT 與inhibitor control組相比，miR-325 inhibitor組miR-325相對(duì)表達(dá)顯著下調(diào)(t=28.93，P<0.01)；與inhibitor control組相比，miR-325 inhibitor組SKOV3細(xì)胞克隆數(shù)目顯著增加(t=9.76，P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值下調(diào)(t=23.78，P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值上調(diào)(t=24.52，P<0.01)，細(xì)胞劃痕愈合率上調(diào)(t=9.35，P<0.05)，結(jié)果說(shuō)明敲減miR-325表達(dá)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMT。見(jiàn)圖3、表5。

圖3 下調(diào)miR-325促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲及EMTFigure 3 Down-regulation of miR-325 promoted the proliferation, invasion and EMT of SKOV3 cells注：A.RT-qPCR檢測(cè)miR-325表達(dá)；B.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖；C.Western blot檢測(cè)SKOV30細(xì)胞EMT蛋白相對(duì)表達(dá)；D.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞遷移情況

表5 下調(diào)miR-325促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲及Table 5 Down-regulation of miR-325 promoted the proliferation, invasion and EMT of SKOV3 cells

2.5 上調(diào)LncRNA FOXD3-AS1通過(guò)miR-325促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMT 與pcDNA-3.1(+)+mimics control組相比，pcDNA-FOXD3-AS1+mimics control組細(xì)胞克隆數(shù)目顯著增加(t=26.53，P<0.01)，細(xì)胞劃痕愈合率上升(t=8.21，P<0.05)，N-cadherin/GAPDH比值顯著上調(diào)(t=18.26，P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值顯著下調(diào)(t=19.65，P<0.01)；pcDNA-3.1(+)+miR-325 mimics組細(xì)胞克隆數(shù)目顯著減少(t=20.14，P<0.01)，細(xì)胞劃痕愈合率降低(t=10.02，P<0.05)，N-cadherin/GAPDH比值顯著下調(diào)(t=22.45，P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值顯著上調(diào)(t=25.23，P<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+miR-325 mimics組相比，pcDNA-FOXD3-AS1+miR-325 mimics組細(xì)胞克隆數(shù)目顯著增加(t=7.98，P<0.05)，細(xì)胞劃痕愈合率上升(t=9.23，P<0.05)，N-cadherin/GAPDH比值顯著上調(diào)(t=27.54，P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值顯著下調(diào)(t=24.83，P<0.01)，見(jiàn)表6、圖4。

表6 上調(diào)LncRNA FOXD3-AS1通過(guò)miR-325促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及Table 6 Up-regulation of LncRNA FOXD3-AS1 promoted SKOV3 cell proliferation, migration and EMT through miR-325

圖4 上調(diào)LncRNA FOXD3-AS1通過(guò)miR-325促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMTFigure 4 Upregulation of LncRNA FOXD3-AS1 promoted SKOV3 cell proliferation, migration and EMT through miR-325注：A.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖；B.Western blot檢測(cè)SKOV30細(xì)胞EMT蛋白相對(duì)表達(dá)；C.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞遷移情況

2.6 miR-325與CDCA5的靶向關(guān)系 CDCA5和miR-325之間的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖5。pGL3-CDCA5 wt+miR-325 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性與pGL3-CDCA5 wt+mimics control組相比顯著下調(diào)(t=17.83，P<0.01)；pGL3-CDCA5 mut+miR-325 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性與pGL3-CDCA5 mut+mimics control組相比無(wú)顯著變化(t=0.73，P>0.05)。見(jiàn)表7。

圖5 miR-325與CDCA5的靶向關(guān)系Figure 5 The targeting relationship between miR-325 and CDCA5

表7 miR-325與CDCA5的靶向關(guān)系Table 7 The targeting relationship between miR-325 and CDCA5

2.7 敲減CDCA5表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMT 與siRNA NC組相比，CDCA5 siRNA組CDCA5基因相對(duì)表達(dá)顯著下調(diào)(t=23.27，P<0.01)；與siRNA NC組相比，CDCA5 siRNA組SKOV3細(xì)胞克隆數(shù)目顯著減少(t=19.26，P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值上調(diào)(t=20.15，P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值下調(diào)(t=21.78，P<0.01)，細(xì)胞劃痕愈合率降低(t=17.62，P<0.01)，結(jié)果說(shuō)明敲減CDCA5表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMT。見(jiàn)表8、圖6。

表8 敲減CDCA5表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及Table 8 Knockdown of CDCA5 expression inhibited the proliferation, migration and EMT of SKOV3 cells

圖6 敲減CDCA5表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMTFigure 6 Knockdown of CDCA5 expression inhibited SKOV3 cell proliferation, migration and EMT注：A.RT-qPCR檢測(cè)CDCA5基因表達(dá)；B.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖；C.Western blot檢測(cè)SKOV3細(xì)胞EMT蛋白相對(duì)表達(dá)；D.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞遷移情況

3 討論

卵巢癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤[13]，其早期缺乏特定的臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者在晚期才被診斷出來(lái)。研究表明，lncRNA在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，是腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)[14-16]。最近研究證實(shí)FOXD3-AS1參與了多種癌癥的發(fā)展，在惡性膠質(zhì)瘤、膀胱癌、鼻咽癌等多種腫瘤中調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲[17-18]。在上述疾病的發(fā)展過(guò)程中，F(xiàn)OXD3-AS1被證實(shí)可以調(diào)控多個(gè)miRNA和基因表達(dá)，如microRNA-150、miR-365-5p、CTCF、S100A、Akt和E2F1[19]。此外還有研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA FOXD3-AS1通過(guò)miR-135a-5p調(diào)節(jié)SIRT1促進(jìn)結(jié)腸腺癌進(jìn)展[20]。然而lncRNA FOXD3-AS1在卵巢癌中的作用及分子機(jī)制尚不清楚。因此我們選擇了lncRNA FOXD3-AS1進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXD3-AS1在卵巢癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)，提示FOXD3-AS1的異常表達(dá)可能與卵巢癌發(fā)展有關(guān)系。進(jìn)一步探討了FOXD3-AS1的生物學(xué)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減FOXD3-AS1表達(dá)會(huì)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及EMT。因此，F(xiàn)OXD3-AS1可能是卵巢癌發(fā)病的關(guān)鍵因素。值得注意的是，先前的一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)OXD3-AS1在鼻咽癌中是一種腫瘤抑制因子，同時(shí)它促進(jìn)結(jié)腸腺癌進(jìn)展[21]，表明FOXD3-AS1在不同腫瘤發(fā)展中可能作為致癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，而本文研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD3-AS1在卵巢癌中發(fā)揮了明顯的促癌作用，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

前期研究證實(shí)，lncRNA廣泛參與ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以作為ceRNA調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄水平。為了進(jìn)一步研究FOXD3-AS1在卵巢癌中的作用機(jī)制，本研究使用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)FOXD3-AS1的靶基因，結(jié)果表明，miR-325是FOXD3-AS1的靶基因。此外，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)FOXD3-AS1與miR-325直接相互作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)microRNA參與了卵巢癌的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡。如有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-584通過(guò)負(fù)調(diào)控LPIN1抑制卵巢癌的進(jìn)展[22]。miR-200c通過(guò)靶向Neuropilin 1致奧拉帕尼耐藥卵巢癌細(xì)胞增敏。此外，miR-142-5p通過(guò)靶向多個(gè)抗凋亡基因增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，miR-325在卵巢癌組織和細(xì)胞系中降低，miR-325敲減促進(jìn)了細(xì)胞增殖和遷移，此外，過(guò)表達(dá)miR-325可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和EMT，逆轉(zhuǎn)了FOXD3-AS1過(guò)表達(dá)的促進(jìn)作用。以上結(jié)果提示miR-325作為抑癌因子參與了卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)OXD3-AS1通過(guò)抑制miR-325的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移。以往研究表明，miR-325通過(guò)HSPA12B/PI3K/AKT/Bcl-2途徑促進(jìn)奧沙利鉑誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞毒性[23]。但尚不清楚FOXD3-AS1/miR-325是否通過(guò)下游靶向基因來(lái)調(diào)控卵巢癌的進(jìn)展。因此，探索FOXD3-AS1/miR-325在卵巢癌中的下游基因是后續(xù)研究的重點(diǎn)。在接下來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)CDCA5是miR-325的下游靶點(diǎn)，有研究表明CDCA5與胃癌、膀胱癌等腫瘤發(fā)展密切相關(guān)[24]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDCA5在卵巢癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)，下調(diào)CDCA5表達(dá)抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和EMT過(guò)程，結(jié)果也提示CDCA5也在卵巢癌的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。然而，F(xiàn)OXD3-AS1/miR-325/CDCA5在卵巢癌細(xì)胞中的功能還有待進(jìn)一步研究，如在細(xì)胞凋亡中的作用等。

綜上所述，lncRNA FOXD3-AS1在卵巢癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。上調(diào)FOXD3-AS1可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，下調(diào)FOXD3-AS1可抑制細(xì)胞的增殖和EMT。軟件預(yù)測(cè)分析表明miR-325是FOXD3-AS1的靶基因，CDCA5是miR-325的靶基因。進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)OXD3-AS1通過(guò)miR-325調(diào)控CDCA5表達(dá)促進(jìn)了卵巢癌的增殖和遷移。

4 結(jié)論

上調(diào)lncRNA FOXD3-AS1可通過(guò)miR-325/CDCA5軸促進(jìn)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，這為進(jìn)一步了解卵巢癌發(fā)展的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。