CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建ROCK2基因敲除肺癌細胞系*

莫婷 張海濤 李苑琪 余華軍 李國丹 魏婷 黃小琴 賈玉芳 涂名進 嚴秀文

(1. 廣東醫(yī)科大學生物化學與分子生物學研究所，廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)科大學生物多肽與蛋白質(zhì)研究應用重點實驗室，廣東 湛江 524023;3.南方海洋科學與工程廣東省實驗室， 廣東 湛江 524023)

肺癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中居高不下[1]，其中超過80%的肺癌是非小細胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)。早期肺癌多無明顯癥狀，臨床上多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀就診時已屬晚期，而晚期肺癌患者整體5年生存率約為17%左右[2]。因此，尋找肺癌新的分子標記物以及潛在的治療靶點，為肺癌患者制定新的治療策略非常重要。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2 (Rho associated coiled coil forming protein kinase 2，ROCK2) 是Rho A小GTP蛋白激酶下游關(guān)鍵的重要效應因子，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要在腦、骨骼肌和心臟表達。ROCK2及其下游靶點參與調(diào)節(jié)肌動蛋白的細胞骨架動力學，從而參與細胞的遷移和運動[3]。此外，ROCK2還在促進腫瘤細胞增殖、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移以及血管生成等多種腫瘤進展過程中發(fā)揮重要作用。關(guān)于ROCK2在惡性腫瘤中的研究越來越多,它的異常表達被發(fā)現(xiàn)與許多癌癥包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等的發(fā)生、發(fā)展機制有關(guān)[4-7]。但有關(guān)ROCK2在肺癌中致病機制的相關(guān)研究報道較少，而它可能作為肺癌發(fā)生的危險因子，對其進行相關(guān)的功能學研究有非常重要的意義。因此，本文通過利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對人肺癌細胞系的ROCK2基因進行敲除，構(gòu)建ROCK2基因敲除的A549、H460穩(wěn)定細胞株，為進一步揭示ROCK2在肺癌細胞中參與調(diào)節(jié)的功能以及在肺癌發(fā)生、發(fā)展機制中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人非小細胞肺癌細胞A549、人大細胞肺癌細胞H460由本實驗室保存提供，1640培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、100X青霉素-鏈霉素溶液及0.25%胰酶消化液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器 Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑和辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗購于美國賽默飛公司；GAPDH和ROCK2一抗均購于Cell Signaling Technology公司；RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Realtime PCR反應試劑盒購自Takara Bio公司。PCR儀器: ABI 7500。

1.3 方法

1.3.1 載體構(gòu)建與表達 Rock-2 CRISPR/Cas9 KO質(zhì)粒、Rock-2 HDR質(zhì)粒購于Santa Cruz Biotechnology公司。根據(jù)CRISPR/Cas9的設(shè)計原則，3種不同的sgRNAs(sgRNA a、sgRNA b和sgRNA c)被設(shè)計用來構(gòu)建針對人類的ROCK2基因,見表1。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Table 1 sgRNA oligonucleotide sequences

1.3.2 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞系A(chǔ)549、H460細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將適量的A549細胞和H460細胞鋪進含1 mL新鮮1640培養(yǎng)基的12孔板中。當細胞密度達到60%～70% 時，更換為不含血清1640培養(yǎng)基，根據(jù)賽默飛的Lipofectamine 3000 試劑實驗方案每個孔分別添加0.5 μg Rock-2 CRISPR質(zhì)粒和0.5 μg Rock-2 HDR質(zhì)粒、1.5 μL的Lipo3000和2 μL P3000轉(zhuǎn)染細胞。將轉(zhuǎn)染后的A549細胞和H460細胞培養(yǎng)24 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.3.4 穩(wěn)定細胞株的單克隆篩選 先確定用于殺死未轉(zhuǎn)染耐藥基因的細胞的嘌呤霉素的最低濃度。將適當數(shù)量的細胞接種到24孔培養(yǎng)皿中，以確保第二天細胞密度達到80%或以上。細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天，更換含有不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(0,0.4,0.6,0.8,1.2,1.6 μg/mL)，更換培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。由于嘌呤霉素的效力非常強，不表達嘌呤霉素抗性基因的細胞可以在2～3天內(nèi)被殺死，因此可以通過顯微鏡觀察確定有效殺死正常細胞的藥物的最低濃度。A549細胞的篩選濃度為1.2 μg/mL，H460細胞的篩選濃度為2.0 μg/mL。穩(wěn)定細胞系的單克隆篩選。A549細胞和H460細胞轉(zhuǎn)染24 h后，分別加入含有1.2 μg/mL和2.0 μg/mL嘌呤霉素的10% FBS-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3天。3天后撤去含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，讓細胞長到合適的細胞密度。用胰酶消化嘌呤霉素陽性細胞，采用有限稀釋法將細胞懸液稀釋，接種到96孔板中，使得每個孔中最多1個細胞，再繼續(xù)培養(yǎng),最終可得到A549單克隆細胞株和H460單克隆細胞株。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測穩(wěn)定細胞株 將收集的細胞加入細胞裂解液，冰上裂解1 h 后離心取上清，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，按每組50 μg蛋白量上樣進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30 min；分離膠：120V，1 h 10 min, 轉(zhuǎn)膜條件為11V, 2.5 h。裁膜后，采用5%脫脂奶粉封閉2 h后，按1∶500孵育ROCK2抗體( CST )、1∶1000孵育GAPDH抗體( CST )。4℃慢搖過夜，12 h回收一抗，1×TBST洗3遍,每次10 min。之后用HRP標記羊抗兔二抗(按1∶2000配置)室溫孵育1 h，回收二抗，1×TBST洗3遍,每次10 min。經(jīng)過曝光、X線膠片顯影成像、定影后，晾干膠片。

1.3.6 RNA提取及RT-qPCR檢測 用總RNA提取試劑盒從細胞中提取總RNA，用Real-Time PCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物序列包括：ROCK2基因上游引物序列：5′-ATGAAACCAATG CTTTACTGCGAAC-3′，下游引物序列：5′-ACATCT GTGTCATTACCACGCTT-3′。內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGA T-3′，下游引物序列為：5′-GAAGGCTGGGGCTCAT TT-3′。所有基因的循環(huán)條件分別為：初始階段95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)。一個周期熔融曲線階段95℃ 15 s，60℃ 1 min，最后95℃ 15 s。用內(nèi)源性管家基因GAPDH的mRNA表達水平歸一化處理后，使用2-ΔΔCt法計算ROCK2的相對表達量，ΔΔCt =(實驗組目的基因Ct值-實驗組內(nèi)參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)。

1.3.7 MTT法檢測細胞活力 A549組分為A549組和 A549 KO組。同樣設(shè)置H460組的實驗分為H460組和H460 KO組。將處于對數(shù)生長期的細胞鋪至96孔板，每孔鋪1000個細胞，每組細胞設(shè)5個復孔，在細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。達到相應的培養(yǎng)時間后，每孔加入100 μL含0.5 μg/mL MTT的培養(yǎng)基溶液, 每組細胞同時設(shè)置調(diào)零孔(只含有培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 h后在酶標儀490 nm波長下檢測吸光度(OD)值。

1.3.8 平板克隆形成實驗 用胰酶消化細胞，計數(shù)后每孔按100個細胞數(shù)量進行鋪板，各挑選一株穩(wěn)定敲除細胞株(A549 KO、H460 KO)與未敲除原始細胞株(A549、H460)進行對比，培養(yǎng)10～14天。肉眼可見細胞群落出現(xiàn)且在用顯微鏡觀察到大于50個細胞克隆數(shù)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1遍，加入甲醇固定30 min，PBS洗1遍。每孔加入1 mL氨基黑溶液染色15 min，吸出后用流水緩慢沖洗干凈染色液，干燥后拍照。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定敲除細胞株的ROCK2蛋白質(zhì)表達水平檢測 各選取3株純合子敲除細胞株進行ROCK2蛋白表達驗證，檢測CRISPR/Cas9技術(shù)的敲除效率。與A549、H460野生株相比較，ROCK2基因敲除株的ROCK2蛋白水平表達完全缺失，驗證ROCK2基因敲除成功。結(jié)果表明成功構(gòu)建ROCK2基因敲除的單克隆A549、H460 細胞株，見圖1。

圖1 Western blot檢測ROCK2蛋白表達Figure 1 Western blot analysis the protein expression levels of ROCK2注：A.檢測ROCK2蛋白在A549與A549 KO細胞中的表達; B.檢測ROCK2蛋白在H460與H460 KO細胞中的表達

2.2 RT-PCR檢測穩(wěn)定敲除細胞株的 ROCK2 mRNA表達水平 與A549和H460原始細胞株相比，ROCK2基因敲除細胞株的mRNA表達水平明顯降低，組內(nèi)的mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 RT-PCR 檢測穩(wěn)定敲除細胞株的mRNA表達水平Figure 2 RT-PCR detects the mRNA expression levels in stable knockout cell lines注：A.檢測A549 KO細胞株中 ROCK2 mRNA的相對表達量; B.檢測H460 KO細胞株中ROCK2 mRNA的相對表達量。①P<0.05

2.3 MTT法檢測敲除細胞株細胞增殖能力ROCK2基因敲除細胞株與A549、H460原始細胞株相比，細胞活力顯著下降。說明ROCK2基因敲除后抑制肺癌細胞的增殖，見圖3。

圖3 ROCK2敲除對肺癌細胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of ROCK2 knockout on the proliferation of lung cancer cells

2.4 平板克隆形成實驗檢測敲除細胞株細胞集落形成能力 與A549、H460 原始細胞株相比較，ROCK2敲除細胞株的增殖能力均低于未敲除細胞,表明ROCK2在促進肺癌細胞增殖方面有重要作用，見圖4。

圖4 ROCK2敲除對肺癌細胞集落形成能力的影響Figure 4 Effect of ROCK2 knockout on the colony formation ability of lung cancer cells

3 討論

ROCK2是Rho GTPases下游效應蛋白研究比較多的靶標之一[3]，也是Rho/ROCK信號通路中的關(guān)鍵信號分子，通過調(diào)節(jié)靶蛋白的活性或磷酸化來調(diào)節(jié)基因表達[8]。許多研究表明ROCK2對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生的多種生物學進程具有重要的作用，包括破壞細胞的粘附連接、肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)、細胞簇的解離和增加細胞的運動性等[3,9-14]。ROCK2在癌癥中過度表達會引起腫瘤細胞遷移和侵襲，參與細胞增殖、細胞形態(tài)和運動調(diào)節(jié)，影響腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[15]。有研究表明ROCK2在肺癌中高表達，它是NSCLC獨立生長和侵襲所必需的，可能是治療NSCLC的一個靶點[16]。阻斷癌細胞的ROCK信號通路能有效地阻止細胞增殖、侵襲和血管生成，從而減少腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。ROCK抑制劑的效果已在肺癌細胞中得到評估，如使用ROCK的抑制劑法舒地爾能抑制A549和95D肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[17-18]。馮飛躍等[19]用組織芯片聯(lián)合免疫組化技術(shù)檢測了135例NSCLC和105例配對癌旁肺組織中的ROCK2表達水平，結(jié)果顯示在NSCLC組織中的ROCK2表達遠高于癌旁肺組織(P<0.001)?；颊唧w內(nèi)的ROCK2在NSCLC中的高表達往往提示預后不良，同時也是肺癌患者預后的危險因素。這些證據(jù)表明ROCK2可能作為一種潛在的肺癌標志物，參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展。雖然目前有研究證實ROCK2在肺癌中的表達增加，但其調(diào)節(jié)肺癌生長的機制研究較少，研究深入了解其在肺癌中的表達及其參與的細胞信號通路機制對于治療肺癌具有重要意義。

利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，可通過靶向腫瘤促進基因、抑制劑治療相關(guān)基因、癌基因和化療耐藥相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)治療肺癌的目的。近年來，CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)以其特異性高、時間短、性價比高等優(yōu)點，被認為是一種有效可行的癌癥治療新方法，為肺癌治療提供了很大的潛力[20-22]。本研究的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)由sgRNA(約20nt，與靶基因序列互補)引導Cas9特異性切割目標基因，造成DNA 雙鏈斷裂(DSBs)，在含有外源DNA修復供體即是有抗生素耐藥選擇標記基因存在的情況下，細胞啟用高保真同源性修復(HDR)機制來對DSB進行修復，會導致抗生素耐藥基因表達以及目標基因提前終止表達，實現(xiàn)高效的基因定向突變[23-24]。另外，由多個外顯子組成的人類基因在蛋白質(zhì)翻譯時可產(chǎn)生多個蛋白質(zhì)異構(gòu)體，所以設(shè)計3個不同的sgRNAs來針對ROCK2的基因編碼區(qū),可使基因敲除效率大幅提高。

本研究通過RT-qPCR技術(shù)檢測，結(jié)果顯示在A549、H460ROCK2基因敲除細胞株的ROCK2 mRNA表達水平仍有殘留表達。分析原因發(fā)現(xiàn)，PCR的引物設(shè)計靶點不在sgRNA敲除序列上，所以檢測仍可擴出ROCK2 的mRNA序列。但是CRISPR/Cas9技術(shù)作用后插入了DNA片段，可能造成移碼突變，導致蛋白質(zhì)無法翻譯，且用免疫印跡法也檢測不到單克隆細胞中ROCK2蛋白質(zhì)的表達，說明這兩株人肺癌ROCK2基因敲除穩(wěn)定細胞株構(gòu)建成功。

本研究將Rock-2 CRISPR/Cas9 KO質(zhì)粒和Rock-2 HDR 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549 細胞和H460細胞，嘌呤霉素篩選出陽性細胞并稀釋至單個細胞繼續(xù)培養(yǎng)。免疫印跡法檢測單克隆細胞中ROCK2蛋白質(zhì)的表達，結(jié)果也證明了細胞株中蛋白ROCK2的表達完全缺失。RT-qPCR檢測基因編輯后的mRNA基因產(chǎn)物進行分析，結(jié)果表明細胞內(nèi)ROCK2 mRNA水平的顯著下降(P<0.05)。敲除ROCK2基因后, 克隆形成平板實驗以及MTT實驗的結(jié)果均能說明A549、H460 細胞增殖能力明顯下降,提示ROCK2正調(diào)控肺癌細胞的增殖。這一實驗結(jié)果也與研究報道的ROCK2作為促進細胞增殖的調(diào)控分子相吻合。

4 結(jié)論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為近年來被大量使用的基因編輯技術(shù)，是研究基因功能的強有力工具。獲得穩(wěn)定敲除ROCK2基因的肺癌細胞株為后續(xù)研究ROCK2在肺癌細胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。