SOX2蛋白及趨化相關基因CCR1、CCR2、MCP-1影響骨髓瘤細胞生物學特性的分子機制

劉曉 李穎 李英華

(哈勵遜國際和平醫(yī)院血液科，河北 衡水 053000)

骨髓瘤是一種B淋巴細胞的惡性腫瘤，主要是在骨髓中的惡性增殖，臨床主要表現(xiàn)為骨疼、缺鐵性貧血、腎衰竭等〔1〕。骨髓瘤細胞(MC)的生長與增殖受骨髓微環(huán)境的影響較大，骨髓中細胞與細胞、細胞外基質與細胞、蛋白與可溶性調節(jié)因子如趨化因子、細胞因子和生長因子等均與骨髓內(nèi)微環(huán)境有密切關系。性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2是MC的一種轉錄因子，參與維持胚胎干細胞多功能性和包括MC形態(tài)發(fā)生的多種發(fā)育過程，決定著細胞分化的方向與速度〔2〕。評估手術切除Ⅰ期肺鱗狀細胞癌(ACA)中SOX2表達的預后價值，證明SOX2可能與肺ACA預后不良有關〔3〕。單核細胞趨化蛋白(MCP)-1是趨化因子的一員，其同時使用CC類趨化因子受體(CCR)1和CCR2作為功能受體〔4～7〕。本研究探討SOX2蛋白及趨化相關基因CCR1、CCR2、MCP-1影響MC生物學特性的分子機制。

1 資料和方法

1.1一般資料 篩選2019年2月至2020年3月送檢的40例骨髓瘤標本。其中男22例，女18例，平均年齡為(62.61±5.62)歲。入組標準：①年齡：60～75歲；②經(jīng)骨髓形態(tài)學確診為多發(fā)性骨髓瘤；③臨床資料完整；④患者的家屬知情并且同意。排除伴先天性免疫性疾病者；獲得內(nèi)部評審委員會的批準。隨機分為兩組，對照(A)組，男8例，女12例，平均年齡(63.38±6.19)歲；試驗(B)組男14例，女6例， 平均年齡(61.27±4.54)歲。兩組一般資料比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2細胞培養(yǎng) 取兩組患者骨髓5 ml，常規(guī)制備單個核細胞，將細胞置于含10%胎牛血清100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素和20 U/ml谷胺酞胺的RFMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于試驗。細胞培養(yǎng)基主要成分包括10%胎牛血清、50 μg/ml鏈霉素和2 mmol/L谷胺酞胺，并補充1%的青霉素，放置于37℃含有5% CO2的條件下培養(yǎng)。每組實驗重復20次，A組：只添加培養(yǎng)液；B組：MC以慢病毒SOX2熒光素酶表達載體(rLV-hsox2-Z s-Green-Puro)轉染。慢病毒轉染實驗步驟：①慢病毒轉染前24 h，將細胞 以1×105/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數(shù)量為2×105/孔左右；②用含有6 μg/ml聚凝胺的2 ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液，37℃孵育；③4 h后加入2 ml新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。

1.3細胞存活試驗 將MC在密度為103個/孔的96孔板中培養(yǎng)，在37℃下培養(yǎng)，然后進行MTT試驗。轉染5 d后，無菌MTT (20 ml，5 mg/ml)被添加到每個的96孔板，37℃孵化4 h。取150 ml的二甲基亞砜(DMSO)加入96孔板中，那么光密使用NanoDrop 2000分光光度計測量490 nm處的光密度(OD)值。在菌落形成試驗中，將轉染的細胞放置在6孔板上，密度為每孔200個細胞，培養(yǎng)2 w，每3 d更換一次培養(yǎng)基。菌落在4%多聚甲醛固定15 min后，用1%結晶紫顯影20 min染色。

1.4細胞的增殖檢測 制備細胞懸液，接種到96孔板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入10 μl CCK8，培養(yǎng)2 h，測定450 nm吸光度。

1.5細胞的凋亡檢測 將細胞濃度調整為1×106/孔/ml，用離心機于3 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加人200 μl的結合沖液重懸細胞，用5 μl的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FIFC)避光室溫25℃標記15 min，用5 μl的碘化丙啶(PI)溶液避光標記5 min，最后加人300 μl的結合緩沖液,流式細胞儀進行流式檢測，并根據(jù)結果計算細胞凋亡率。

1.6RNA提取、逆轉錄和實時PCR定量 使用TRIzol試劑按照說明書從細胞中分離出總RNA，用Hairpin-itTMPCR定量試劑盒按照廠家說明書進行cDNA合成及后續(xù)實時定量PCR，內(nèi)源對照為小核GAPDH?；虮磉_評估用TransScript第一鏈cDNA合成SuperMix進行總RNA的逆轉錄，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix，按照制造商提供的協(xié)議進行實時定量PCR。該過程使用7500序列檢測系統(tǒng)進行，使用分析軟件計算miRNA和基因的表達水平。引物序列：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′；上游引物：5′-CGCTTCGGCAGCATTACT-3′，下游5′-GTCGAGATGGGATAC CCTT-3′；上游引物：5′-CTGACGTCGAGTGGGC-3′，下游5′-AGTCG-AGATGGGATAC CCTTA-3′；上游引物：5′-ACAG-TCGAGATGGGATAC CCTTACCATTACT-3′，下游5′-CT-GCTGACGTCGAGTGGGCAA-3′。

1.7SOX2蛋白表達水平 免疫印跡分析法對總蛋白進行分離和定量分析。將預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗3次。然后加入裂解液對細胞〔RIPA：苯甲基磺酰氟(PMSF)=100∶1〕進行裂解，低溫裂解30 min后，破碎細胞主要利用超聲細胞粉碎儀，3 000 r/min離心10 min，離心所得上清液即總蛋白，-80℃保存，備用。用BCA法測定蛋白的濃度，以牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線。將上述提取得到的總蛋白跑十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜并將所得膜封閉在5%脫脂奶粉液中，室溫封存40 min。然后將SOX2的一抗和兔抗人SOX2多克隆抗體分別加入其中孵育過夜。加入兔抗鈣黏蛋白多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗波形蛋白多克隆抗體(1∶5 000)、兔抗Snai1多克隆抗體(1∶1 000 )、兔抗NT5E多克隆抗體(1∶500)、鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶2 000)，4℃水平過夜，加入二抗孵育2 h，用電化學發(fā)光(ECL)法顯色。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1細胞總數(shù)測定 與A組相比，B組細胞總數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2細胞存活率 與A組相比，B組細胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

2.3細胞凋亡檢測 與A組相比，B組細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表1。

2.4SOX2蛋白表達 與A組相比，B組SOX2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組細胞總數(shù)、存活率、凋亡率、SOX2蛋白及CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA相對表達量比較

圖1 兩組SOX2蛋白表達水平

2.5CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA表達 與A組相比，B組CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA基因表達的上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 兩組CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA的表達水平

3 討 論

骨髓瘤患者通常以骨痛起病，溶骨性病變是典型的臨床癥狀〔8〕，骨病變部位大多位于人體的中心骨架、顱骨及長骨，可引起劇烈的骨疼痛、病理性骨折及骨質疏松等〔9〕。MC在疾病進展的過程中，很少位于骨髓以外的組織和器官，其大部分時間內(nèi)位于骨髓中〔10〕。MC細胞附近破骨細胞的增多及激活，成骨細胞的減少及活性抑制，都有可能導致溶骨增多或者成骨減少，從而誘發(fā)骨髓瘤病變〔11〕。MC毗鄰處，溶骨性損害往往更顯著，這可能與MC所處的骨髓微環(huán)境密切相關，微環(huán)境的改變常引起SOX2蛋白表達異常，但是SOX2蛋白在MC中表達尚未得到廣泛研究〔12〕。

本研究結果說明SOX2蛋白在MC的產(chǎn)生和增殖過程中具有重要作用。研究表明〔13〕，在骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展中，骨髓微環(huán)境起著至關重要的作用。Eltoukhy等〔14〕研究表明癌癥治療結果預測算法包含了對“干細胞”通路的基因組分析通路，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤類型的回顧性研究中顯示出較高的預后準確性。MCP-1具有趨化作用，可激活多種炎性細胞，其對白細胞的作用譜與MCP-3相似，包括單核細胞、T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞、嗜堿性細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞，但與MCP-3不同，MCP-1對嗜酸性粒細胞無活性。Fu等〔15〕從白細胞研究中獲得的證據(jù)表明MCP-2可能與這些C-C趨化因子共享受體，但MCP-2的實際功能受體尚未被確認。

由于細胞的趨化因子受體表達多樣性和功能性質，主要由破骨細胞產(chǎn)生，在這些細胞上很難識別特定配體所使用的受體。大量的CCR1和CCR2趨化因子受體已被克隆，并在細胞上進行功能表達〔16～18〕。CCR1是MCP-3和MIP-1a/RANTES的受體，而CCR2主要由MCP-1和MCP-3共享。雖然CCR2已被報道無法直接對MCP-2產(chǎn)生作用，但相關結論是由于合成的MCP-2不能誘導轉染HEK293細胞所含的鈣作用，及MCP-2未能使MCP-1所誘導的鈣通量脫敏〔19〕。而MCP-1具有在單核細胞誘導過程中的鈣動員效果不佳的情況及單核細胞的趨化活動，使得MCP-1使用的信號通路不同于其他的碳趨化因子〔20〕。盡管如此，MCP-1亦可有效地使MCP-1-induced單核細胞的遷移過程減弱，并通過同源失活的過程以利用同一MCP-1受體。然而，在本次研究中，這顯然不能通過本機建立細胞，而需使用轉染的細胞以表達單一的趨化因子受體，亦是今后的研究方向。

綜上，多發(fā)性骨髓瘤雖為漿細胞病，但MC與正常漿細胞的免疫表型不同。SOX2蛋白在細胞特定周期的高效表達可加速MC快速凋亡，且CCR1、CCR2和MCP-1基因通過在細胞中的過表達可調節(jié)MC的增殖，導致疾病及抗凋亡反應的發(fā)生。