煙草腺毛優(yōu)勢表達(dá)基因NtMYB108b的克隆及分析

余 婧，趙會納，閆筱筱，郭玉雙，王召軍，余世洲，王 兵，雷 波*

1.貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號 550081 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002

表皮毛為植物表皮細(xì)胞突起的特殊結(jié)構(gòu)，通常分為分泌型和非分泌型。分泌型表皮毛（腺毛）能特異合成和儲存多種類型的次生代謝物，在防御食草動物和病原體等生物脅迫以及應(yīng)對紫外線照射、強(qiáng)光或干旱等非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用［1-3］。此外，腺毛還是特殊次生代謝物合成的“細(xì)胞工廠”［3-4］，薄荷（Mentha spicata）、薰衣草（Lavandula angustifolia）、青蒿（Artemisia annua L.）等植物的腺毛分泌物是生產(chǎn)香精香料或有效藥物成分的原料［5-8］。煙草（Nicotiana tabacum L.）的腺毛占總表皮毛數(shù)量的85%左右［9］，其特異合成的類西柏烷二萜、蔗糖酯等分泌物是煙葉香味和香氣的前體物質(zhì)，對煙葉的香氣品質(zhì)有積極影響［10-11］。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）是一類結(jié)合在啟動子上的特異蛋白，可激活（或抑制）靶基因在特定的時間或空間表達(dá)［12］。研究表明，MYB、MYC和WRKY等一些在植物腺毛中優(yōu)勢（或特異）表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控腺毛的發(fā)生、發(fā)育或次生代謝物的合成與分泌。Xu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，番茄（Solanum lycopersicum）SlMYC1基因參與了VI型腺毛形成和萜烯的生物合成；Wang等［14］的研究表明，MsYABBY5基因在薄荷腺毛中特異表達(dá)并負(fù)向調(diào)控萜烯類物質(zhì)的合成；Qin等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在青蒿中AaMYB17基因的過表達(dá)可增加分泌型腺毛的密度并增加青蒿的青蒿素含量。其中，MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，根據(jù)MYB保守結(jié)構(gòu)域重復(fù)的數(shù)量可分為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB 4個類型［15-16］。R2R3-MYB是MYB轉(zhuǎn)錄因子最大的亞家族，通常分為22個亞組，每個亞組成員功能相似［15，17］。目前，R2R3-MYBs在煙草中的生物學(xué)功能已有報道，如NtMYB44b基因能響應(yīng)ABA等激素誘導(dǎo)并對干旱脅迫產(chǎn)生應(yīng)答［18］；NtMYB4基因是調(diào)節(jié)煙草類黃酮生物合成的關(guān)鍵基因，并且在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［19］；NtMYB12基因通過正向調(diào)控NtCHS等黃酮醇生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，增加黃酮醇的含量并增強(qiáng)煙草對低磷脅迫的耐受性［20］。然而，MYB108-like基因在植物腺毛中相關(guān)功能的研究還鮮見報道。

本實(shí)驗(yàn)室前期以煙草K326葉片、去腺毛葉片和腺毛為材料，獲得了3者的比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)18個注釋為MYB的基因在腺毛中上調(diào)表達(dá)明顯，其中5個注釋為MYB108，然而這些MYB108基因在煙草中的生物學(xué)功能仍未知。為此，從栽培煙草K326腺毛的cDNA中克隆NtMYB108b基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析并檢測NtMYB108b基因在煙草不同組織中的相對表達(dá)量，同時分析葉片中NtMYB108b基因在響應(yīng)SA等激素處理和干旱脅迫后的表達(dá)情況，旨在為揭示NtMYB108b基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品采集

實(shí)驗(yàn)材料為煙草（Nicotiana tabacum L.）K326。苗期培養(yǎng)條件為：16 h光照/8 h黑暗，溫度（25±2）℃，相對濕度60%。煙苗在5月上旬移栽大田，按當(dāng)?shù)卦耘啻胧┻M(jìn)行管理。使用Harada等［21］的凍刷法，用液氮速凍煙草葉片，然后用毛刷輕輕刮下腺毛備用，去除腺毛的葉片即為去腺毛葉片。采集苗期、團(tuán)棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期和成熟期植株葉片用于檢測NtMYB108b基因在不同生育期的相對表達(dá)量；采集現(xiàn)蕾期植株的頂葉、上二棚葉、腰葉、下二棚葉和腳葉用于檢測NtMYB108b基因在不同葉位中的相對表達(dá)量；采集苗期植株的根、莖及盛花期植株的花、葉和腺毛組織用于檢測NtMYB108b基因在不同組織中的相對表達(dá)量。分別向苗期植株葉片噴灑乙烯利（ET，5 mmol/L）、茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol/L）、水楊酸（SA，50 mg/L）、赤霉素（GA，100 mg/L）和脫落酸（ABA，10 μmol/L），并分別在噴灑后第0、6、12、24和48 h采集樣品用于檢測NtMYB108b基因的激素處理響應(yīng)；使用濃度為100 g/L的聚乙二醇（PEG-6000）澆灌根部模擬干旱脅迫，分別于處理后第0、2、4、8和16 d采 集 葉 片 組 織 用 于 檢 測NtMYB108b基因的干旱脅迫響應(yīng)。每組試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。上述材料采集后用液氮速凍，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NtMYB108b基因克隆

根據(jù)K326腺毛轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，初步獲得NtMYB108b基因的全長CDS序列。分別采用EasyPure?Plant RNA Kit、TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司），從煙草腺毛中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用2×TransStart?KD Plus PCR SuperMix Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）從cDNA中擴(kuò)增目的基因，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸50 s，共35個循環(huán)；68℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳后將目的條帶回收，連接至中間克隆載體pEASY-Blunt Zero（北京全式金生物技術(shù)有限公司）并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；采用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測蛋白的親/疏水性；使用TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；分別 使 用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）預(yù)測蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)；SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）用于預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域；Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plantmulti/）用于預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位；使用DNAMAN軟件比對分析氨基酸序列；使用MEGA 6.0軟件，在p-distance模型下，采用Neighbor-Joining（NJ）算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap設(shè)置為1 000次重復(fù)。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

使用ViiA7熒光定量PCR儀（美國ABI公司）檢測NtMYB108b基因在煙草中的相對表達(dá)情況。β-Actin為內(nèi)參基因，qRT-PCR試劑盒為日本TAKARA公司生產(chǎn)的TB Green?Premix DimerEraserTM（Perfect Real Time），反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸34 s，40個循環(huán)。用于qRT-PCR的引物信息見表1。反應(yīng)結(jié)束后用公式2-ΔΔCT計算基因的相對表達(dá)量［22］。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 NtMYB108b基因的CDS序列擴(kuò)增及分析

M.DL2 000 DNA Marker；1.NtMYB108b基因PCR擴(kuò)增片段圖1 NtMYB108b全長CDS序列的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR production of NtMYB108b full-length CDS

以栽培煙草K326的腺毛cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得NtMYB108b（LOC107809713）長度為828 bp的CDS序列（圖1、圖2），編碼蛋白長度為275個氨基酸（圖2）。Protparam分析結(jié)果顯示，NtMYB108b蛋白的分子式為C1365H2113N417O443S11，相對分子質(zhì)量31.81 kDa，理論等電點(diǎn)PI 5.82，不穩(wěn)定系數(shù)為（Ⅱ）53.24，屬于不穩(wěn)定蛋白，總平均親水性系數(shù)為-0.903。采用ProtScale在線工具進(jìn)一步分析NtMYB108b蛋白的親/疏水性，發(fā)現(xiàn)其親水區(qū)域（負(fù)值）多于疏水區(qū)域（正值），表明NtMYB108b是一種親水性蛋白（圖3A）。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，NtMYB108b蛋白不存在跨膜區(qū)域（圖3B）；Plant-mPLoc預(yù)測NtMYB108b蛋白定位于細(xì)胞核。利用SOMPA分析NtMYB108b蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖4），發(fā)現(xiàn)其無規(guī)則卷曲含量最高，占50.91%，其次是α-螺旋（38.55%）、延伸鏈（6.54%）和β-轉(zhuǎn)角（4.00%）。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖5所示，NtMYB108b蛋白具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)特征，這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（其富含無規(guī)則卷曲及α-螺旋）一致。蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，NtMYB108b的N端有兩個SANT保守結(jié)構(gòu)域，分別由51個（第13～第63位）和49個（第66～第114位）氨基酸組成，其C端第146～第182位氨基酸處有一個低復(fù)合物區(qū)域（圖6），推測NtMYB108b屬于R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子。

圖2 NtMYB108b全長CDS序列及其編碼氨基酸序列Fig.2 Sequences of full-length CDS and amino acids of NtMYB108b

圖3 NtMYB108b蛋白親/疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Hydrophilic/Hydrophobicity and transmembrane structure analyses of NtMYB108b protein

2.2 多重序列比對及進(jìn)化樹分析

根據(jù)2.1中蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果，NtMYB108b屬于R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子（圖6），從在線網(wǎng)站https：//www.arabidopsis.org/上下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）126個R2R3-MYB的氨基酸序列并與NtMYB108b共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)Stracke等［23］的報道進(jìn)行分組，結(jié)果如圖7所示，NtMYB108b與擬南芥S20亞組成員AtMYB108、AtMYB78、AtMYB112等聚為一支。從進(jìn)化樹分析結(jié)果可以預(yù)測，NtMYB108b與S20亞組成員的生物學(xué)功能相似。將NtMYB108b的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blastp比對分析，結(jié)果顯示，NtMYB108b與其他茄科煙草屬的MYB108、馬鈴薯StMYB108以及番茄SlMYB78等的氨基酸序列相似度較高，其中，與絨毛狀煙草NtomMYB108的相似度最高，為100.00%。選擇與NtMYB108b相似度較高的物種及其氨基酸序列與擬南芥S20亞組成員一起進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)樹化樹，多重序列比對結(jié)果如圖8所示，這些MYB108-like蛋白在N端含有高度保守的R2R3-SANT結(jié)構(gòu)域，而C端的差異較大，這符合R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。將圖8中的氨基酸構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)NtMYB108b與絨毛狀煙草NtomMYB108在同一分支（圖9）且它們的序列相似性為100.00%，說明NtMYB108b很可能來源于其祖先種絨毛狀煙草。

圖4 NtMYB108b蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction on secondary structure of NtMYB108b protein

圖5 NtMYB108b蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction on tertiary structure of NtMYB108b protein

圖6 NtMYB108b蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.6 Domains of NtMYB108b protein

圖7 NtMYB108b與擬南芥R2R3-MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree for NtMYB108b and Arabidopsis R2R3-MYB proteins

圖8 不同物種MYB108-like氨基酸序列比對分析Fig.8 Multi-sequence alignment of MYB108-like amino acids of different species

圖9 不同物種MYB108-like氨基酸序列進(jìn)化樹分析Fig.9 Phylogenetic tree for MYB108-like amino acids of different species

2.3 NtMYB108b基因在不同組織中的表達(dá)分析

使用qRT-PCR方法調(diào)查NtMYB108b基因在煙草不同生育期及不同葉位葉片中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NtMYB108b基因在團(tuán)棵期葉片中的相對表達(dá)量較高，在旺長期時表達(dá)量較低（圖10A）；現(xiàn)蕾期時，NtMYB108b基因在頂葉、上二棚葉、腰葉、下二棚葉和腳葉5個葉位葉片中的表達(dá)量沒有顯著差異（圖10B）。在煙草根、莖、花、葉和腺毛中均檢測到NtMYB108b基因的表達(dá)（圖10C），但不同組織的表達(dá)量不同，其中NtMYB108b基因在腺毛中的相對表達(dá)量最高，達(dá)94.39，而在葉片中的相對表達(dá)量為1，這與本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致，即NtMYB108b基因在葉片的腺毛中優(yōu)勢表達(dá)；NtMYB108b基因在根、莖和花中的相對表達(dá)量分別為17.42、5.79和66.49，在花中的表達(dá)量較高，僅次于腺毛。

圖10 NtMYB108b基因的組織表達(dá)分析Fig.10 Relative expression level of NtMYB108b gene in different tissues

2.4 NtMYB108b對激素處理及干旱脅迫的響應(yīng)

NtMYB108b基因在ET處理后第6、12、24和48 h均能被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在第12 h時相對表達(dá)量最高，為18.28（圖11A）；SA處理后第6 h，NtMYB108b基因表達(dá)上調(diào)，在第12 h時達(dá)到峰值，相對表達(dá)量為14.16，在第24 h時顯著下調(diào)（圖11C）。當(dāng)采用PEG-6000模擬干旱脅迫時，NtMYB108b基因的表達(dá)量在處理后第2 d時顯著升高，此時其相對表達(dá)量為15.12，在處理后第4和8 d時有所下降（圖11F）。而經(jīng)MeJA、GA和ABA處理后，NtMYB108b基因的表達(dá)量較未處理時（0 h）相比并無顯著差異（圖11B、圖11D、圖11E）。上述結(jié)果說明，NtMYB108b基因能被ET、SA及干旱脅迫所誘導(dǎo)，而對MeJA、GA和ABA的處理則無響應(yīng)。

圖11 NtMYB108b基因在不同激素處理及干旱脅迫后的表達(dá)分析Fig.11 Relative expression level of NtMYB108b gene under different hormone or drought stress treatments

3 討論

從煙草品種K326的腺毛cDNA中克隆了NtMYB108b基因的CDS序列，經(jīng)生物信息分析，NtMYB108b基因編碼蛋白屬于R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子（圖6、圖8），來源于其祖先種絨毛狀煙草。相同R2R3-MYB亞組成員的基因功能具有一定相似性［15，17］，如AtMYB11、NtMYB12、GhMYB1a等S7亞組成員調(diào)控類黃酮的生物合成［15，20，24］，S9亞組成員MIXTA-like轉(zhuǎn)錄因子參與植物表皮細(xì)胞的生長發(fā)育［1，7］，S1亞組成員是蠟質(zhì)生物合成的調(diào)控因子［25-26］。本研究中發(fā)現(xiàn)NtMYB108b屬于S20亞組成員（圖7），從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果可初步推測NtMYB108b基因的功能與S20亞組成員相似，該組成員主要參與植物器官衰老、萜類物質(zhì)合成、脅迫響應(yīng)等過程［27-30］。Li等［28］對丹參（Salvia miltiorrhiza）的110個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了全基因組分析，預(yù)測S20亞組成員是萜類物質(zhì)生物合成的調(diào)控因子，因此，NtMYB108b可能是煙草中參與萜類物質(zhì)合成的潛在調(diào)控基因。

本研究中發(fā)現(xiàn)NtMYB108b基因在煙草腺毛中優(yōu)勢表達(dá)，在花中的表達(dá)量略低，說明NtMYB108b在煙草腺毛及花中可能有更重要的生物學(xué)功能。此外，根據(jù)Zhang等［30］的研究，月季（Rosa hybrida）RhMYB108基因在衰老的花瓣中高水平表達(dá)，同時通過ET和JA信號通路可靶向調(diào)節(jié)衰老相關(guān)基因并調(diào)節(jié)花瓣的衰老。本研究中發(fā)現(xiàn)NtMYB108b基因在ET誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)（圖11A），且在花中的表達(dá)量也較高（圖10C），初步推測NtMYB108b基因通過ET信號途徑，參與了花瓣的衰老。在激素處理及干旱脅迫的實(shí)驗(yàn)中觀察到了NtMYB108b基因在ET、SA及干旱脅迫處理后均顯著上調(diào)表達(dá)（圖11A、圖11C、圖11F），這些結(jié)果暗示NtMYB108b基因在生物及非生物脅迫的調(diào)控中起著重要作用，并且可能與ET和SA信號途徑有關(guān)。此外，NtMYB108b基因?qū)ο倜l(fā)育調(diào)控激素MeJA［1，5，31］和GA［32］的處理無響應(yīng)（圖11B、圖11D），推測該基因可能不參與調(diào)控?zé)煵菹倜鹗蓟蛏扉L。

4 結(jié)論

從煙草K326的腺毛中克隆了NtMYB108b基因的全長CDS序列，其開放閱讀框?yàn)?28 bp，編碼275個氨基酸。NtMYB108b蛋白定位于細(xì)胞核，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子S20亞組成員，來源于其祖先種絨毛狀煙草。NtMYB108b基因在葉片中的相對表達(dá)量為1，在腺毛及花中的相對表達(dá)量分別為94.39和66.49，表明NtMYB108b在煙草腺毛及花中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。激素及干旱脅迫實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明NtMYB108b的功能可能涉及ET、SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及干旱脅迫。