一株鳙源魯氏耶爾森氏菌的分離鑒定及其感染的腸道病理損傷

劉蕓娜 尚信池 張培軍 盧玉婷 劉佳 汪惠慶 閆子豪 李月紅

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 教育部動物產(chǎn)品與質量安全重點實驗室，吉林長春 130118； 2 吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢測中心，吉林長春 130000)

魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)是一種革蘭氏陰性細菌，隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、耶爾森菌屬(Yersinia)，可以引起淡水魚和海水魚的耶爾森氏菌病。腸道紅口病(enteric red mouth，ERM)也稱為耶爾森氏菌敗血癥，患腸道紅口病的魚體表癥狀多數(shù)為腹部、下頜及嘴周出現(xiàn)大量出血點，肛門腺發(fā)炎、紅腫，剖檢呈大量腹水，肝臟壞死，腸道嚴重脹氣，腸壁薄而脆等。該病最早于20世紀50年代在美國發(fā)現(xiàn)，是一種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類尤其是鮭鱒魚類易感、嚴重危害漁業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的細菌性疾病[1-3]。魯氏耶爾森氏菌主要引起冷水性鮭鱒魚類發(fā)病，但近年來在我國相繼發(fā)現(xiàn)該病原體也可感染鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)等鯉科魚類[3-5]，而且最常見的是由血清型為01的病原體菌株引起的[6-7]。耶爾森氏菌病現(xiàn)在已經(jīng)廣布全球，這可能是因為在全球化發(fā)展過程中，被感染動物的運輸導致了疾病的傳播[8]。該病在我國北方很少發(fā)生，目前尚未見鰱、鳙大面積暴發(fā)該病的報道。但就全國來看，該病在地理分布上還是呈擴增趨勢的。

為了進一步闡明病原體的分類狀況，本試驗從吉林省某養(yǎng)殖基地患病鳙魚的血液、器官和傷口中分離出細菌分離株，通過VITEK?MS全自動分析系統(tǒng)和16S rRNA基因的測序分析，鑒定并確認了該菌，同時進行了系統(tǒng)發(fā)育分析和體外藥物敏感性測試。此外，還提供了有關受影響鳙魚的臨床病變以及腸道組織病理學的觀察結果。本研究旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預防提供合理的技術指導，促進淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

發(fā)病鳙魚取自吉林省某養(yǎng)殖基地，體質量為2 kg。健康鳙魚購自常盛魚苗孵化場，體質量為20～30 g。

主要試劑：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(LB)、革蘭氏染色試劑盒購自上海銘睿生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、Taq酶等購自TaKaRa公司。

主要儀器：法國梅里埃公司的VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)(進行鑒定)，VITEK?MS全自動快速微生物質譜檢測系統(tǒng)，透射電子顯微鏡，YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，SW-CJ-2FD型超凈工作臺，TG-16WS臺式高速離心機，Life Pro梯度PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 菌株的分離

無菌條件下，分別取病魚的腐爛肌肉和血液，加入無菌的生理鹽水制成勻漿，將勻漿稀釋至合適的稀釋度，取其中3個最適稀釋度的稀釋液200 μL并涂布于LB培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群進行純化培養(yǎng)，挑取單菌落，用體積分數(shù)為80%的甘油對其進行菌種的保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 革蘭氏染色觀察

取無菌潔凈載玻片，將分離的菌株轉移到載玻片上，用酒精燈干燥，使其固定，經(jīng)結晶紫染液初染，碘液媒染，酒精脫色，番紅染液復染后即可通過鏡檢觀察染色結果。

1.3.2 透射電子顯微鏡觀察

將細菌培養(yǎng)液以3 000 r/min離心10 min后進行負染色電子顯微鏡檢查。使用1 mL注射器(取下針頭)提取0.1～0.2 mL細菌懸液，小心滴在銅網(wǎng)上，再用一塊無菌濾紙吸收銅網(wǎng)邊緣的殘留液體，然后靜置2 min(此時未完全干燥)。用1 mL注射器(取下針頭)將0.1～0.2 mL的染色液滴到帶有細胞的銅網(wǎng)上，靜置1～2 min，然后使用一小塊濾紙吸收銅網(wǎng)邊緣的染料溶液，自然干燥，5 min后用電子顯微鏡觀察。

1.3.3 生理生化鑒定

采用法國梅里埃公司的VITEK?MS全自動快速微生物質譜檢測系統(tǒng)進行生理生化鑒定，鑒定板為革蘭氏陰性菌鑒定板，試驗結束后觀察及分析結果。

1.3.4 分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

用LB液體培養(yǎng)基沖洗收集純化的菌株，提交至庫美生物工程股份有限公司進行PCR擴增和16S rRNA測定。16S rRNA基因的擴增引物為27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’)和1492R(5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3’)，將菌株的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中細菌的16S rDNA進行比對，從中選取10株與該菌株基因序列最相似的菌株和5種水產(chǎn)常見病原菌，采用ClustalW軟件進行多序列匹配分析，用MEGA 6.0軟件包中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹，通過1 000次Bootstrap檢驗置信度[9]，并將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行確認[10]。

1.4 回歸感染試驗

取上述已鑒定的菌液500 μL，使用10 mL LB培養(yǎng)液(28 ℃，120 r/min)過夜培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)好的菌液離心后棄掉上清液，用生理鹽水分別稀釋至2.84×108、2.84×107、2.84×106、2.84×105cfu/mL，隨后進行攻毒試驗。將健康鳙魚分為5組，每組10尾魚，其中4個處理組(編號1～4)魚體分別使用上述4個濃度腹腔注射0.2 mL的魯氏耶爾森氏菌(JL9510)分離物，對照組則腹腔注射0.2 mL的生理鹽水。在攻毒試驗的7 d里，試驗魚均分別飼養(yǎng)在密閉的養(yǎng)殖箱中，水溫保持在18～20 ℃。所有魚按體質量的1%投飼，隔天換水一次，清除糞便、殘飼等污物。試驗期間，每天記錄試驗魚的臨床體征，及時取出死魚，對死亡的標本進行微生物學分析，以確定由魯氏耶爾森菌引起的死亡率。

1.5 病理損傷研究

取發(fā)病鳙魚和健康鳙魚的腸道分別固定于4%的中性福爾馬林溶液中，采用蘇木精-伊紅染色法進行組織病理學研究。

1.6 藥敏試驗

采用藥敏紙片的方法進行藥敏試驗。使用LB培養(yǎng)液(28 ℃，過夜，120 r/min)培養(yǎng)細菌，在超凈工作臺上吸取200 μL菌液涂布于LB板，取藥敏紙片貼于該板上。將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃下培養(yǎng)24 h。用游標卡尺測量抑菌圈直徑，判斷該菌株對氟苯尼考和環(huán)丙沙星兩種抗生素的敏感程度。

2 結果

2.1 臨床癥狀

發(fā)病鳙魚精神沉郁，游動遲緩，漂浮于水面，體表出現(xiàn)大量出血點及壞死灶(見圖1)。胸鰭基部及尾鰭基部肌肉出血明顯，口部出血明顯，頭部潰爛，肉眼可見骨條。肝臟腫大(見圖2)，背部腐爛嚴重(見圖1-d)。腸道嚴重充氣，腸壁組織炎癥明顯，呈半透明狀(圖2-b)。顯微鏡下檢查血液、黏液及潰瘍灶組織，未見寄生蟲和真菌。

2.2 病原菌的分離

從自然發(fā)病鳙魚的血液、肝、腎及體表潰爛處均分離到了1株優(yōu)勢菌株，編號為JL9510。在28 ℃下培養(yǎng)12 h后，可見菌株在LB平板上形成直徑約為1 mm的半透明菌落(見圖3)。鏡檢觀察，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色后鏡檢結果見圖4，電鏡下檢查病魚血液中的細菌見圖5。經(jīng)VITEK?MS全自動快速微生物質譜檢測，結果為魯氏耶爾森氏菌，置信度為99.9。

圖3 LB培養(yǎng)基上的白色透明菌落

圖4 革蘭氏染色顯微鏡下觀察分離純化的細菌結果(油鏡×20)

圖5 負染色電子顯微鏡檢查從患病鳙魚血液中發(fā)現(xiàn)的桿狀細菌(比例尺=2 μm)

2.3 回歸感染試驗

回歸感染試驗中，處理組4從試驗第1天開始即有試驗魚發(fā)病死亡，處理組2、3從第2天，處理組1從第3天開始有試驗魚發(fā)病死亡，對照組則未出現(xiàn)死亡情況(見圖6)。經(jīng)寇氏法計算分析，LD50=8.99×106cfu/mL。病檢結果顯示，回歸感染發(fā)病魚的癥狀與自然發(fā)病魚的一致(見圖7)。在回歸感染發(fā)病鳙魚的肝臟和腸道處分離到與菌株JL9510表面形態(tài)一致的菌株，因此推斷該菌對鳙魚具有致病性。

圖6 回歸感染試驗鳙魚的成活率

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)16S rRNA基因擴增，得到1 406 bp的PCR產(chǎn)物，將庫美生物工程股份有限公司測序的結果在GenBank中進行BLAST比對分析，用Mega 6.0進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。16S rRNA測序結果顯示，菌株JL9510與已知菌株JQ657818.1Yersiniaruckeri序列相似性達到99.98%，同源關系最近。通過系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，JL9510與菌株JQ657818.1Yersiniaruckeri聚為一支(見圖8～9)。

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗判定參照美國臨床實驗室標準化委員會的VET01-A4標準進行。通過試驗測量抑菌直徑，發(fā)現(xiàn)菌株JL9510對氟苯尼考敏感，對環(huán)丙沙星耐藥(見表1)。

表1 魯氏耶爾森氏菌JL9510的藥物敏感性試驗結果

2.6 腸道組織學觀察

通過組織學觀察發(fā)現(xiàn)，感染組鳙魚腸組織損傷明顯，腸腔中可見壞死脫落的腸道組織，黏膜層結構大面積缺失，僅局部可見殘余的腸絨毛，黏膜下層水腫(見圖10)。

圖10 對照組和感染組鳙魚的腸組織切片

3 討論和分析

耶爾森氏菌是腸道紅口病(enteric red mouth，ERM)的病原體，該病幾乎波及所有的鮭鱒魚類，給鮭魚養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的影響。20世紀50年代，研究人員最初在愛達荷州哈格曼河谷(美國)的患病鱒魚中分離到了致病性耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)[11]。此次我國北方暴發(fā)的魯氏耶爾森氏菌病也導致大量鳙魚死亡，給養(yǎng)殖場帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。通過先進的技術手段，魯氏耶爾森氏菌的致病機理已被闡明，溫度是涉及毒力基因調節(jié)的主要因素之一，毒力基因在溫度變化時被高度誘導。在其他因素保持不變的情況下，溫度16 ℃比12 ℃試驗條件下魯氏耶爾森氏菌引起的鮭魚死亡率更高[12]。在本研究中，菌株JL9510可以在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中生長。

本試驗通過多種鑒定手段，確定了患病鳙魚血液中的魯氏耶爾森氏菌。資料顯示，之前也有魯氏耶爾森氏菌引起水產(chǎn)動物感染發(fā)病的報道。本試驗中，患病鳙魚有腸道充氣、腹腔嚴重積水等臨床癥狀；藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，該菌對氟苯尼考敏感，這與方蘋等[4]的研究結果相似。病魚口腔充血、腸道充氣、腸壁充血和腹腔積水等現(xiàn)象，與已報道的魯氏耶爾森氏菌病相似[13]。目前尚無使用疫苗控制該疾病的可能性，但藥敏試驗進一步表明，與使用其他常規(guī)藥物相比，使用氟苯尼考可能會降低重新感染的機會[14-16]。為避免濫用藥物，在治療魚類細菌性疾病時，應根據(jù)藥物敏感性試驗結果選擇敏感的抗生素。本試驗結果可用于對感染耶爾森氏菌的鳙魚進行有效處理，為養(yǎng)殖安全用藥提供參考。

本試驗中，被耶爾森氏菌感染的鳙魚主要表現(xiàn)出器官壞死、變性、出血和敗血癥。對其腸道進行組織學觀察，發(fā)現(xiàn)致病菌嚴重破壞小腸絨毛，使腸壁變薄，影響腸道健康，這與其他宿主因耶爾森氏菌引起的臨床癥狀不同。耶爾森氏菌的地理分布和寄主范圍已顯著擴大，目前影響幾乎所有養(yǎng)殖鮭魚。除北美外，在歐洲國家也發(fā)現(xiàn)了該病，鮭魚發(fā)病后死亡率一般為30%～40%[17]。在我國，鳙魚受到人們的普遍青睞，尤其近年來市場多樣化的需求使得鳙魚養(yǎng)殖量逐年增加，而耶爾森氏菌也能感染鳙魚，因此應給予足夠的重視。在鳙魚育種過程中，應加強對病原體的監(jiān)測，從養(yǎng)殖管理、水質監(jiān)測等方面加強預防[18-19]，及時采取有效的防控措施并適當使用藥物，避免魚體感染的進一步擴大。