探討冰硼液沖洗對離體牙根管內(nèi)糞腸球菌感染的臨床療效*

郭曉霞 孫俊毅 劉曉斌**

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西 西安 710004)

根管沖洗是根管治療的主要步驟之一，能有效沖洗掉根管內(nèi)感染細(xì)菌、殘留牙髓和根管預(yù)備切削的牙本質(zhì)碎屑，維持根管的清潔[1]。良好的沖洗液[2]還應(yīng)具有廣泛的抗菌譜和高效抗菌性、溶解牙髓和壞死組織、表面張力低到達(dá)根管預(yù)備器械無法到達(dá)的區(qū)域如牙本質(zhì)小管、殘留沖洗液也能提供長期抗菌效果、無毒無致癌等副作用[3]。我科采用冰硼沖洗液根管沖洗取得較好效果，現(xiàn)通過體外實驗研究,對比臨床中常用的療效確切的1%NaClO液，探討其對根管內(nèi)糞腸球菌感染的療效。

1 儀器與材料

1.1儀器 YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);DG3022全自動酶聯(lián)免疫測定儀(華東電子管廠，德國);GU-P204便攜式電動牙鉆機(上海硅萊醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試藥 2.5%NaClO 溶液(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；17% EDTA 溶液(江西凱隆化工有限公司);PBS(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。復(fù)方冰硼沖洗液：由冰片、硼砂、玄明粉、石膏、徐長卿5味中藥配制而成(由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供并配制)。每250 mL復(fù)方冰硼沖洗液含冰片2 g、硼砂5 g、玄明粉5 g、石膏15 g、徐長卿15 g，制備方法：石膏水煎30 min后加入徐長卿再煎30 min，取上清液250 mL加入冰片、硼砂、玄明粉，冰箱4℃保存，使用前取出溶液搖勻即可。

1.3實驗菌株E.faecalis國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC33186，美國菌種保藏中心);腦心浸液粉(Brain Heart Infusion，BHI)(法國生物梅里埃公司)；瓊脂粉(杭州微生物試劑有限公司)。

2 方法

2.1離體牙收集與處理

2.1.1離體牙收集 收集因正畸原因被拔除、未接受過牙體牙髓治療的離體、單根、直牙35顆，要求牙體保持完整、未行牙髓治療、根管圓形。去除根尖周軟組織，清潔牙面保存在生理鹽水中備用。

2.1.2離體牙處理 在流動水冷卻下，距離根管孔13 mm處用金剛砂片高速截去牙冠，保留牙根，用拔髓針去除牙髓組織，K型銼預(yù)備至20#疏通根管、建立通暢通道，應(yīng)用1% NaClO和17%EDTA交替沖洗。水冷卻下用砂片在距離離體牙根尖孔5 mm處垂直于牙體長軸磨出環(huán)形凹槽，但不穿透根管壁。用流動樹脂將根尖孔和牙根外側(cè)封閉。所有離體牙均獨立置于含5 mLBHI培養(yǎng)液中密封，高溫高壓消毒滅菌(121℃，15 MPa，20 min)。所有樣本置于37℃厭氧培養(yǎng)(80%N2、10%CO2、10%H2)24 h，培養(yǎng)液保持透明，表明滅菌效果可靠。

2.2建立糞腸球菌感染離體牙根管模型 參照前期制備糞腸球菌感染根管模型的方法[4]，取糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC33186)常規(guī)復(fù)蘇，劃線接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧(80%N2、10%CO2、10%H2)培養(yǎng)24 h，根據(jù)革蘭染色鏡檢和生化鑒定，證實無其它細(xì)菌污染，挑選單個菌落接種在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，并調(diào)節(jié)菌懸液濃度為 D(A630)1.0。

根管內(nèi)注入菌懸液(菌懸液以平齊根管口為準(zhǔn))，試管內(nèi)加入10 mL無菌BHI 培養(yǎng)液，每48 h更換新鮮無菌BHI培養(yǎng)液，共孵育4 w。隨機選取5顆逐步稀釋培養(yǎng)在BHI瓊脂培養(yǎng)基，確認(rèn)培養(yǎng)過程無污染。培養(yǎng)結(jié)束后，余30顆離體牙無菌條件下取出，生理鹽水沖洗根管，氣槍干燥10 s，將無菌干燥紙尖分別置入根管中達(dá)工作長度，停留1 min，取樣。

2.3分組處理 空白組：生理鹽水+超聲蕩洗1 min，10顆離體牙；陽性對照組：1%NaClO+超聲蕩洗1 min，10顆離體牙；治療組：冰硼溶液+超聲蕩洗1 min，10顆離體牙。

為了保持樣本統(tǒng)一性，要求所有離體牙根管預(yù)備后形態(tài)一致。首先采用標(biāo)準(zhǔn)法預(yù)備至40#達(dá)工作長度，0.06錐度K3鎳鈦器械采用冠向下法預(yù)備至30#，此時預(yù)備至11 mm，達(dá)到所有離體牙根管長度、錐度、形態(tài)一致。預(yù)備過程中每更換器械使用各組沖洗液沖洗，最后一次沖洗完用生理鹽水沖洗根管，氣槍干燥10 s，取樣。

2.4細(xì)菌計數(shù) 根管內(nèi)細(xì)菌計數(shù)：各組取樣放入裝有1 mL生理鹽水的Eppendorf管中，搖勻振蕩1 min，10倍系列稀釋后接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后計算菌落數(shù)(CFU·mL-1)。

根尖4 mm不同牙本質(zhì)深度內(nèi)細(xì)菌計數(shù)：所有離體牙從凹槽處截斷，保留距根尖5 mm牙根，生理鹽水沖洗干凈，除去殘留碎屑，依次使用60#、80#、100#不銹鋼K銼在根管內(nèi)旋轉(zhuǎn)各8圈，總計達(dá)到牙本質(zhì)深度4 mm，提取牙本質(zhì)小管深度0～100 μm、100～200 μm、200～300 μm內(nèi)殘留存活的糞腸球菌，用1 mL生理鹽水將提取的管壁和K銼的粉末沖洗至無菌Eppendorf管中，搖勻振蕩1 min，10倍系列稀釋后接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后計算菌落形成單位(CFU·mL-1)。

3 結(jié)果

3.1根管預(yù)備沖洗前后根管內(nèi)細(xì)菌計數(shù)結(jié)果比較 根管預(yù)備沖洗前，空白組、陽性對照組、治療組根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量差異不大(P>0.05)；根管預(yù)備沖洗后，三組根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量均不同程度降低，組間比較，陽性對照組和治療組之間無顯著差異(P>0.05)，但兩組細(xì)菌計數(shù)結(jié)果均明顯低于空白組，存在顯著差異(P<0.05)，見表1。

表1 根管預(yù)備沖洗前后三組根管內(nèi)細(xì)菌計數(shù)結(jié)果比較

3.2根管預(yù)備沖洗后對根尖4 mm不同牙本質(zhì)深度內(nèi)細(xì)菌計數(shù)結(jié)果比較 三組隨著牙本質(zhì)深度增加，均呈現(xiàn)出抗菌效果逐漸降低的現(xiàn)象，空白組降低最明顯，陽性對照組和治療組降低相對較少，雖然在不同牙本質(zhì)深度陽性對照組和治療組抗菌效果無顯著差異，但是牙本質(zhì)0～100 μm、100～200 μm區(qū)域細(xì)菌計數(shù)陽性對照組<治療組，而牙本質(zhì)200～300 μm區(qū)域細(xì)菌計數(shù)治療組<陽性對照組，說明隨著牙本質(zhì)深度增加，治療組抗菌效果降低幅度最小。

表2 根尖4 mm不同牙本質(zhì)深度內(nèi)細(xì)菌計數(shù)結(jié)果比較

4 討論

本研究建立感染根管模型選擇的細(xì)菌是糞腸球菌[5]，這是因為糞腸球菌是根管內(nèi)最難清除干凈的細(xì)菌[6]，在根管治療失敗、難治性根尖周炎病例中檢出率高[7]，一方面糞腸球菌在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、惡劣環(huán)境中生存能力很強，其黏附于牙本質(zhì)小管內(nèi)或管間牙本質(zhì)，以生物膜狀態(tài)生存[8-9]；另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌對常用的根管治療藥物如：NaClO、氫氧化鈣存在耐藥性[10]。最后，課題組前期已經(jīng)成功制備了糞腸球菌感染模型，技術(shù)成熟。

本研究選擇1%NaClO作為陽性對照，NaClO溶液是目前臨床上最為推薦使用的根管沖洗液[11]，大量實驗證明NaClO溶液對糞腸球菌具有良好的抗菌能力[12]。其通過氯化作用和強氧化作用獲得良好的抗菌作用，溶于水后產(chǎn)生的NaOH、HOCl使其獲得良好的組織溶解能力[13]。NaClO溶液也存在很多不足之處[14]，比如：臨床常選用的NaClO溶液濃度為1%～5.25%，濃度增加會提高抗菌能力，但同時會增加對組織的刺激損傷、降低牙本質(zhì)抗彎強度和彈性模量[15]，故學(xué)者們在不斷尋找新的根管沖洗液。

冰硼沖洗液[16]含有冰片、硼砂、玄明粉，其中冰片味辛苦微寒，能清熱止痛、瀉火解毒。硼砂具有清熱解毒，消腫防腐的作用。玄明粉咸寒軟堅，清熱、導(dǎo)熱下行；為提高抗菌和清潔效果[17]，本研究在遵循中醫(yī)組方原則基礎(chǔ)上，又加入具有石膏和徐長卿兩味中藥，石膏辛甘性寒，善清瀉邪熱[18]；徐長卿具有解毒鎮(zhèn)痛的作用[19]。諸藥合用，在清熱瀉火，解毒鎮(zhèn)痛等方面具有顯著療效。

本研究結(jié)果提示：1%NaClO溶液沖洗根管，配合使用超聲沖洗設(shè)備，對根管壁定植的糞腸球菌有極高的抑菌效果，與以往學(xué)者研究報道一致[20]。使用冰硼液聯(lián)合超聲沖洗根管，與1%NaClO聯(lián)合超聲沖洗組，對根管壁糞腸球菌的抗菌效果沒有顯著差異，說明冰硼液抗菌效果明顯。

綜上所述，冰硼液可以有效清除感染根管表面和根尖4 mm不同牙本質(zhì)深度的糞腸球菌。但仍存在許多不足：由于本研究在體外牙模型上進(jìn)行，與患者根管內(nèi)細(xì)菌感染狀態(tài)尚有差異；現(xiàn)有組方劑量的冰硼液是否為最佳抗菌濃度尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。