澤明降脂顆粒制備工藝的優(yōu)化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉睿 位佳琳 位鴻 尚坤 何蕊 陳少波 汪景 楊戈**

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 1301171；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130117)

澤明降脂方是長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科楊戈主任的經(jīng)驗(yàn)方，為方便患者攜帶服用，將此方研發(fā)制成安全有效的顆粒制劑，并申請(qǐng)為院內(nèi)制劑。此方由澤瀉、決明子、陳皮、黃芩等十二味中藥組成，具有利水消腫，理氣健脾，活血祛瘀，消食化痰的作用，治療痰瘀互結(jié)所致的高脂血癥，應(yīng)用于高脂血癥的防治近十年，取得滿意臨床療效?，F(xiàn)對(duì)澤明降脂顆粒的提取工藝、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究[1-3]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 JH2102 型電子天平(0.001 g，上海精密科學(xué)儀器)；CP225D 雙量程電子分析天平(0.0001 g，0.000 01 g)(德國賽多利斯)；DZF-1型真空干燥箱、DGH-9640型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊)；CAMAG薄層色譜成像儀(瑞士)；LC-2010A高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，LabSolutions工作站(日本島津)。

1.2試藥 陳皮對(duì)照藥材(批號(hào)：120969-201510)、決明子對(duì)照藥材(批號(hào)：121011-201506)、橙黃決明素(批號(hào)：111900-201605)、大黃酚(批號(hào)：110796-201621)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-201318)，均購自中國藥品生物制品檢定院；供試樣品：澤明降脂顆粒樣品1(批號(hào)：20191201)、樣品2(批號(hào)：20191202)、樣品3(批號(hào)：20191203)，均為長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1提取工藝的研究

2.1.1藥材吸水率的測(cè)定 按處方比例取藥材，加水1000 mL浸泡，每隔 30 min 測(cè)定一次，待藥材全部浸透，測(cè)定時(shí)間為2 h，測(cè)得混合藥材吸水率為153%，確定第1次提取時(shí)需多加2倍量的水。

2.1.2水煎煮工藝條件的考察 采用正交試驗(yàn)對(duì)水煎煮工藝進(jìn)行考察，加水量、煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間是影響提取效果的主要因素，每個(gè)因素選擇三個(gè)水平，使用正交表L9(34)安排試驗(yàn)，見表1?？疾熘笜?biāo)：干浸膏出膏率、干浸膏中的黃芩苷含量[4-6]。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

2.1.3綜合評(píng)分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以出膏量占30%，以干浸膏中含黃芩苷的總量占70%進(jìn)行加權(quán)，并進(jìn)行方差分析。見表2、3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表3 方差分析結(jié)果表

2.1.4正交試驗(yàn)結(jié)果分析 以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，直觀分析，A3>A2>A1，B3>B2>B1，C1>C2>C3，最優(yōu)條件：A3B3C1，方差結(jié)果：B因素水平變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響，選擇B3水平，A、C因素沒有顯著的影響，因素水平可任選其一。

綜合分析上述結(jié)果，考慮節(jié)省能源和工時(shí)，煎煮法條件宜為A3B3C1，即：加4倍量水，煎煮3次，每次1 h。

3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

3.1薄層色譜鑒別

3.1.1陳皮的薄層色譜鑒別 供試品溶液制備：取本品顆粒10 g，研細(xì)，加70%甲醇30 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。對(duì)照藥材溶液制備：另取陳皮對(duì)照藥材粉末0.3 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。陰性對(duì)照溶液制備：另取按處方比例和制備工藝制備除去陳皮的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陳皮的陰性對(duì)照溶液。吸取對(duì)照藥材溶液10 μL，供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各15 μL，分別點(diǎn)于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視[7-8]。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性無干擾，見圖1。

注：(從左到右)陳皮對(duì)照藥材；供試品20191201；供試品20191202；供試品20191203；陰性對(duì)照

3.1.2決明子的薄層色譜鑒別 供試品溶液的制備：取本品顆粒10 g，研細(xì)，加70%甲醇30 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸至近干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解。水液加乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用水10 mL洗滌，棄去洗滌液，取乙酸乙酯液加于氧化鋁柱(200～300 目，5 g，內(nèi)徑為1 cm，干法裝柱)上，用乙酸乙酯10 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解。對(duì)照藥材溶液制備：另取決明子對(duì)照藥材粉末0.5 g，同供試品方法制成對(duì)照藥材溶液。陰性對(duì)照溶液制備：另取按處方比例和制備工藝制備除去決明子的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成決明子的陰性對(duì)照溶液。對(duì)照品的制備：再取橙黃決明素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品，加無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取混合對(duì)照品溶液5 μL、對(duì)照藥材溶液10 μL、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各15 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-丙酮(2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干[9-10]。結(jié)果供試品色譜中，在與大黃酚對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榉奂t色(大黃酚)，而陰性無干擾，見圖2。

注：(從左到右)橙黃決明素、大黃酚混合對(duì)照品；決明子對(duì)照藥材；供試品20191201；供試品20191202；供試品20191203；陰性對(duì)照

3.2含量測(cè)定(HPLC法)

3.2.1色譜條件 Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸水(47∶53)；體積流量1 mL·min-1；檢測(cè)波長280 nm，進(jìn)樣量10 μL。

3.2.2溶液的制備

3.2.2.1對(duì)照品溶液 精密稱取黃芩苷對(duì)照品6.62 mg，加甲醇定容至5 mL量瓶中，搖勻得濃度為1.324 mg·mL-1的溶液；精密吸取上述溶液0.5 mL，甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，得濃度為66.2 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。再精密吸取上述溶液1 mL，甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，得濃度為6.62 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

3.2.2.2供試品溶液 取本品顆粒1.5 g，精密稱定，精密加入70%乙醇100 mL置250 mL具塞錐形瓶中，精密稱定，加熱回流3 h，放冷，濾過，再次稱定，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻。精密量取上述溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[11-13]。

3.2.2.3陰性對(duì)照溶液 按處方比例和制備工藝制備除去黃芩的陰性樣品溶液，濃縮后減壓干燥，稱取中粉1.5 g，按3.2.2.2供試品溶液制備方法“精密稱定……”制得陰性對(duì)照溶液。

3.2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取“3.2.2”項(xiàng)下各溶液，在“3.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見圖3。黃芩苷與其他成分均達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)不低于3000，陰性無干擾。

A.黃芩苷對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.缺黃芩陰性對(duì)照樣品

3.2.4線性關(guān)系考察 精密吸取“3.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 μL、4 μL、8 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色譜儀，在“3.2.1”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=3036350.15X+1766.73，r=0.9999，黃芩苷線性范圍為0.0132 μg～0.1324 μg。結(jié)果見圖4。

圖4 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“3.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“3.2.1”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得黃芩苷峰面積RSD值為0.87%，表明儀器精密度良好。

3.2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批樣品(20191201)共6份，按供試品溶液項(xiàng)下制備，依法獨(dú)立測(cè)定，計(jì)算樣品含量，測(cè)得黃芩苷的含量RSD值為1.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)20191201)，室溫下于0，2，4，8，12，24 h，在“3.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得黃芩苷的峰面積RSD值為1.26%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量同一批樣品(20191201)0.75 g，共6份，分別精密加入濃度為0.662 mg·mL-1的黃芩苷對(duì)照品溶液8 mL，精密加入70%乙醇40 mL置250 mL具塞錐形瓶中，精密稱定，加熱回流3 h，放冷，濾過，再次稱定，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻。精密量取上述溶液1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.9樣品含量測(cè)定 精密稱取3批中試顆粒，每批兩份，按“3.2.2”項(xiàng)方法配制供試品溶液，在“3.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表5。

表5 三批中試含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1)

4 討論

4.1制備工藝部分 澤明降脂顆粒由十二味中藥組成，組方新穎，療效確切，在臨床中應(yīng)用時(shí)多為湯劑，因此本顆粒在制備過程中仍然采取水煎煮的方法，把藥材本身的吸水率考慮在內(nèi)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取方法，以干浸膏的出膏率和干浸膏中黃芩苷的含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確定出最佳煎煮工藝，該方法可以有效保證制劑中有效成分的含量。

4.2薄層色譜鑒別 本文中分別對(duì)君藥決明子、臣藥陳皮進(jìn)行了薄層色譜鑒別，由于該方藥味多，成分復(fù)雜，所以在進(jìn)行薄層色譜鑒別前對(duì)供試品的處理方法進(jìn)行了研究，有研究表明決明子的乙酸乙酯提取物是降脂的活性部位之一，所以在處理供試品時(shí)分別加入甲醇、乙酸乙酯將成分溶出，再用氧化鋁柱進(jìn)行分離提純，該方法可以很好的鑒別本顆粒中的決明子藥材[14-17]；研究中發(fā)現(xiàn)鑒別陳皮時(shí)使用70%甲醇溶解本顆粒，過濾蒸干后再加甲醇溶解即可，該方法簡便，易操作。

4.3高效液相色譜法 黃芩苷為黃芩藥材中的主要活性成分，其主要具有抗炎、抗氧化等藥理作用，近年來的研究表明黃芩苷主要用于與其他藥物配伍后聯(lián)合應(yīng)用，用于高脂血癥的治療，本制劑采用HPLC法測(cè)定黃芩苷的含量，簡單易行、方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。因此以黃芩苷含量作為澤明降脂顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)是合理可行的[18-20]。