高效液相色譜法測(cè)定糕點(diǎn)中的富馬酸二甲酯和納他霉素

張慧瓊，鄭陸紅，黃柳霞，陳麗香

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442）

糕點(diǎn)食品的保質(zhì)期較短，在儲(chǔ)存、流通過程中易因微生物大量繁殖而引起食品的腐敗和變質(zhì)。生產(chǎn)企業(yè)會(huì)在生產(chǎn)中添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀、富馬酸二甲酯和納他霉素等防腐劑來保證糕點(diǎn)食品的質(zhì)量和風(fēng)味[1]。富馬酸二甲酯又稱胡索酸二甲酯，化學(xué)名為反丁烯二酸二甲酯，俗稱防霉保鮮劑霉克星1號(hào)。因其高效、持久穩(wěn)定且應(yīng)用范圍廣泛，所以常被用于果蔬食品、服飾、化妝品、中藥材等的防腐、防霉、保鮮方面。富馬酸二甲酯有毒，對(duì)人體有腐蝕性和致過敏性，可經(jīng)食道吸入對(duì)人體腸道、內(nèi)臟產(chǎn)生腐蝕性損害，尤其對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育造成了重大的危害[2]。納他霉素又稱匹馬霉素，能有效抑制各種酵母菌、霉菌的生長(zhǎng)，又能抑制真菌毒素的產(chǎn)生，可廣泛用于乳酪、肉制品、糕點(diǎn)等食品的防腐保鮮及真菌治療[3]。雖然我國將富馬酸二甲酯列為第二種違禁食品添加劑，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[4]規(guī)定，納他霉素的最大使用量為0.3 g·kg-1，且為表面使用。但不良廠家、不法商販為降低成本、延長(zhǎng)貨期，在月餅、面包等常見的糕點(diǎn)食品中違規(guī)使用，因此加強(qiáng)對(duì)糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯和納他霉素的檢測(cè)評(píng)價(jià)是十分重要的。目前國內(nèi)檢測(cè)富馬酸二甲酯和納他霉素的標(biāo)準(zhǔn)方法是高效液相色譜法，但是兩個(gè)項(xiàng)目分別檢測(cè)，而糕點(diǎn)的檢測(cè)任務(wù)繁重，且富馬酸二甲酯的實(shí)驗(yàn)過程需要配制多種試劑，耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。因此，本文基于快速簡(jiǎn)便篩查的目的，研究了同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯和納他霉素的含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌糕點(diǎn)，市售；綠豆糕中富馬酸二甲酯含量檢測(cè)內(nèi)部質(zhì)控樣品，86.46 mg·kg-1：大連中食國實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司；富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.70%）：Dr.Ehrenstorfer 公司；納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度91.1%），BePure 公司；甲醇（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；?shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q Advantage A10 制備的一級(jí)水，Millipore 公司；0.22 μm有機(jī)相濾膜，艾杰爾。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity II 高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器（DAD），美國安捷倫科技有限公 司；TC-C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美國安捷倫科技有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB25-12DT），寧波新芝生物科技股份有限公司；漩渦混合器（IKA MS 3 basic），德國IKA 公司；純水機(jī)（Milli-Q Advantage A10），默克密理博公司；電子天平，十萬分之一，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

精確稱取富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.03 mg，用甲醇充分溶解，并稀釋定容至10 mL 容量瓶，搖勻，配制成1.000 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，貯存于0 ～4 ℃冰箱中，有效期90 d。

精確稱取納他霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.98 mg，用甲醇充分溶解，并稀釋定容至10 mL 容量瓶，搖勻，配制成1.000 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，貯存于0 ～4 ℃冰箱中，有效期90 d。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)混合使用液的配制

從富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.000 mg·mL-1）和納他霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.000 mg·mL-1）中分別吸取1 mL 至同一個(gè)10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混勻，配制成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

從富馬酸二甲酯和納他霉素的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液（100 μg·mL-1）中 分 別 吸 取0.004 mL、0.010 mL、0.050 mL、1.000 mL、5.000 mL、10.000 mL、20.000 mL 至100 mL 容量瓶，用甲醇水溶液（75+25，V/V）定 容，配 制 成0.004 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.050 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1、5.000 μg·mL-1、10.000 μg·mL-1和20.000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.4 試樣前處理

糕點(diǎn)均勻粉碎后，準(zhǔn)確稱取試樣2.00 g，置于50 mL 離心管中，加入75%甲醇15 mL，渦旋搖勻3 min，再置于超聲波清洗機(jī)中超聲提取30 min，再用75%甲醇定容至25 mL，后置于離心機(jī)中以4 000 r·min-1，離心5 min，上清液過0.22 μm 有機(jī)濾膜，收集濾液約2 mL 供高效液相色譜儀分析測(cè)定。

1.5 色譜條件

Agilent TC-C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇與水（70 ∶30，V/V）為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，波長(zhǎng)210 nm 和304 nm，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇與水作為流動(dòng)相[5]，考察了甲醇和水的不同比例，甲醇∶水（V∶V）為90 ∶10、85 ∶15、80 ∶20、75 ∶25、70 ∶30、65 ∶35、60 ∶40、55 ∶45、50 ∶50 和45 ∶55。經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)，甲醇比例較高時(shí)，兩者分不開，且響應(yīng)不高。本試驗(yàn)最終選擇甲醇-水70 ∶30 為流動(dòng)相，能更好地把富馬酸二甲酯、納他霉素洗脫出來，且峰型對(duì)稱。富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1，通過與空白樣品的比較，其保留時(shí)間為3.0 min。納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2，通過與空白樣品的比較，其保留時(shí)間為4.6 min。

圖1 富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

圖2 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確認(rèn)

取10 μg·mL-1富馬酸二甲酯和納他霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別采用DAD 在波長(zhǎng)190 ～400 nm 進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖3、圖4。富馬酸二甲酯的最大吸收波長(zhǎng)是210 nm，納他霉素的最大吸收波長(zhǎng)是304 nm。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇210 nm 作為富馬酸二甲酯的檢測(cè)波長(zhǎng)，選擇304 nm 作為納他霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖

圖4 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖

2.2 樣品提取溶劑的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

富馬酸二甲酯溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮和醇類，微溶于乙醚和水；納他霉素微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸，難溶于大部分有機(jī)溶劑。駱健美等[6]采用平衡法測(cè)定了納他霉素在不同溶液中的溶解度，最終發(fā)現(xiàn)在甲醇中的溶解效果是最好的。由于糕點(diǎn)基質(zhì)油脂比較多，且含有豐富的蛋白，若選用甲醇提取，會(huì)使溶于甲醇的一些油脂雜質(zhì)也被帶到溶劑中，造成基線波動(dòng)，又因選用甲醇水作為流動(dòng)相，官詠儀等[7]也認(rèn)為選擇甲醇水作為此兩種物質(zhì)的提取溶劑，能使上機(jī)的溶液濃度更接近流動(dòng)相。因此，本方法選用甲醇-水作為提取富馬酸二甲酯和納他霉素的溶劑。

2.2.2 提取溶劑比例的確認(rèn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，本試驗(yàn)采用甲醇-水作為提取溶劑，考察了甲醇和水的不同比例，甲醇∶水（V∶V）為0 ∶100、5 ∶95、10 ∶90、15 ∶85、20 ∶80、25 ∶75、30 ∶70、35 ∶65、40 ∶60、45 ∶55、50 ∶50、55 ∶45、60 ∶40、65 ∶35、70 ∶30、75 ∶25、80 ∶20、85 ∶15、90 ∶10、95：5 和100 ∶0，對(duì) 富 馬 酸 二 甲 酯 和納他霉素的回收率，結(jié)果如圖5 所示。經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)，納他霉素在甲醇水的不同比例中，回收率為72%～105%，但富馬酸二甲酯在甲醇比例為70 以下時(shí)，回收率均低，在甲醇比例為70 以上時(shí)，回收率明顯良好。最終在大量試驗(yàn)下，且考慮提取溶液的濃度能更接近流動(dòng)相。因此，本方法選用75%甲醇作為提取富馬酸二甲酯和納他霉素的溶劑。

圖5 甲醇水不同比例分別對(duì)富馬酸二甲酯和納他霉素回收率的影響

2.3 方法的線性范圍及檢出限

在上述分析條件下，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)樣10 μL，以標(biāo)準(zhǔn)工作使用液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制校正曲線，富馬酸二甲酯的線性回歸方程為Y=70.247 5X-2.949 6，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 91，線性良好；納他霉素的線性回歸方程為Y=30.507 2X-0.485 4，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 92，線性良好。以信噪比S/N=3 時(shí)計(jì)算本方法的檢出限，S/N=10 時(shí)的濃度為定量限，具體見表1。

表1 糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯和納他霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.4 方法回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取不含富馬酸二甲酯和納他霉素的基質(zhì)樣品，分別加入富馬酸二甲酯和納他霉素5 mg·kg-1、125 mg·kg-1、225 mg·kg-13個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，按照“1.4 試樣前處理”進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平做6個(gè)平行，測(cè)定回收率和精密度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，富馬酸二甲酯的回收率在97%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.71%～0.94%；納他霉素的回收率在95.1%～99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.20%～0.86%，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）附錄F 中回收率和精密度的要求。本研究建立的方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，系統(tǒng)誤差小，測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確，分析方法可行性高。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

按照上述方法對(duì)含納他霉素糕點(diǎn)和含有富馬酸二甲酯的糕點(diǎn)質(zhì)控樣進(jìn)行檢測(cè)，并與國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。質(zhì)控樣的測(cè)試結(jié)果采用“z-比分?jǐn)?shù)”評(píng)價(jià)，經(jīng)分析，|Z|≤2，測(cè)試結(jié)果滿意。結(jié)果表明，本方法的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，適用于糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯和納他霉素的同時(shí)測(cè)定。

表3 實(shí)際樣品的檢測(cè)

3 結(jié)論

本文建立了一種以高效液相色譜同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中的富馬酸二甲酯和納他霉素含量的分析方法，對(duì)樣品加入不同水平的儲(chǔ)備溶液，經(jīng)75%甲醇超聲處理后，在優(yōu)化后的高效液相色譜條件下進(jìn)行上機(jī)分析，結(jié)果表明，富馬酸二甲酯和納他霉素均線性良好，且回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也符合分析方法的要求。該法具有樣品簡(jiǎn)單處理、測(cè)試快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量樣品的快速測(cè)定。