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    油茶變態(tài)葉中糖類物質(zhì)的單糖組成與抗氧化活性分析

    2022-09-23 12:00:08孫海紅董國(guó)強(qiáng)呂享華孫永紅薛魯燕張瑞巧王文嬌趙征宇石大川
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年17期
    關(guān)鍵詞:水提液單糖半乳糖

    孫海紅, 董國(guó)強(qiáng), 蔡 葵, 呂享華, 孫永紅, 薛魯燕, 張瑞巧, 王文嬌, 趙征宇, 石大川

    (1.青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東青島 266100; 2.青島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,山東青島 266100)

    油茶(Abel)是山茶花中一種重要的木本食用油料樹種,它主要分布于我國(guó)的湖南、湖北、江西、廣西、浙江和福建等省份,是我國(guó)獨(dú)有的一種食用油料樹種,別稱楂木,通常為常綠灌木林,有時(shí)為小喬木,高度為3~4 m,極少數(shù)可達(dá) 8 m。油茶樹皮呈淡黃褐色,平滑但不裂;小枝微被短柔毛;單葉互生;葉柄長(zhǎng)4~7 mm,有毛;葉片多為厚革質(zhì),形狀為卵狀橢圓形或卵形,長(zhǎng)度為3.5~9.0 cm,寬度多為1.8~4.2 cm,其頂點(diǎn)相對(duì)較鈍,基部呈楔形,邊緣多呈細(xì)鋸齒形,上部則呈亮綠色,通常為無毛或中脈有硬毛,下面中脈基部有毛或無毛,其側(cè)脈不明顯;花為兩性花,1~3朵生于枝頂或葉腋上,直徑達(dá)到3~5 cm,無梗;通常有5張萼片,形狀接近圓形,外表面有被絹毛;花瓣數(shù)一般為5~7瓣,花色為白色,花分離,形狀為倒卵形至披針形,長(zhǎng)度多為2.5~4.5 cm,先端常有凹缺,外表面有毛;雄蕊更多,無毛外觀,外部花絲僅有基部連合;上部子房長(zhǎng)有密集白色絲狀絨毛,花柱先頂三淺裂;蒴果形狀為近球形,直徑通常達(dá)到3~5 cm,其果皮較厚,為木質(zhì),室背2~3裂;種子形狀為背圓腹扁形,長(zhǎng)度達(dá)2.5 cm;花期為10、11月,果期在次年10月。油茶的栽培歷史較為悠久,分布區(qū)域很廣,栽培面積很大,用途較多,由于其具有收斂止血、解毒之功效,因此常常被用于治療鼻衄病、皮膚潰爛瘙癢、瘡疽等癥狀。此外,油茶具有較強(qiáng)的清除自由基、抗腫瘤、抗炎、降血脂的作用,在食品藥品、營(yíng)養(yǎng)保健、日用化工等領(lǐng)域也具有良好的應(yīng)用價(jià)值。但是,目前油茶葉資源并未得到良好、可循環(huán)的利用,特別是在油茶整形修剪、低產(chǎn)油茶林的改造等不當(dāng)應(yīng)用下,大量油茶葉常被作為廢棄物丟棄,使其功能和使用價(jià)值大大降低,極大地浪費(fèi)了資源。通過大量的研究發(fā)現(xiàn),油茶葉中也含有多種不同的黃酮類化合物,黃酮類化合物常常具有良好的抗油脂氧化性能,并有報(bào)道指出,油茶提取物可用于治療一些無名腫毒病癥、犬咬或是火燒成瘡等疾病。油茶葉茶多糖是一類成分復(fù)雜的糖類混合物。此外,油茶多糖功效很多,具有抵抗各種輻射、增加人體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量、提高人體免疫力的作用,還可以降低人體血糖。通過泡飲用油茶制成的粗茶來治糖尿病的嘗試和方法較為流行,原因可能是茶多糖發(fā)揮了作用。但是茶多糖的抗氧化能力較弱,在受到胞外真菌的寄生后,有關(guān)茶耳的理化性質(zhì)及其糖類成分的研究在我國(guó)和世界范圍內(nèi)還有待拓展,因此本研究旨在分析油茶葉可食用真菌在營(yíng)養(yǎng)成分及體外抗氧化性方面的作用。

    1 試驗(yàn)方法

    本試驗(yàn)的總流程見圖1。

    1.1 油茶和茶耳水提物及多糖的提取

    油茶葉產(chǎn)自湖南省株洲市,采集時(shí)間為2018年4月。試驗(yàn)時(shí)間為2018年5—6月,試驗(yàn)地點(diǎn)為青島農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。將油茶葉葉片和茶耳葉片粉碎后按 1 g ∶30 mL的料液比加入蒸餾水,放入恒溫水浴鍋中于65 ℃提取2 h,分別抽濾得到油茶葉濾液(CF)、茶耳濾液(TF)。取一部分濾液旋蒸濃縮后按1 ∶4的體積比加入無水乙醇醇沉,將沉淀物在 4 ℃ 條件下靜置過夜,取其沉淀物放置于離心機(jī)內(nèi)并且于4 000 r/min離心15 min,將沉淀物再次溶解于蒸餾水后,用離心機(jī)離心以除去水中那些不溶性雜質(zhì),使用流水透析72 h,將透析后的樣品經(jīng)冷凍干燥后,便可得到油茶粗多糖(CCP)、茶耳多糖(TCP),進(jìn)而計(jì)算粗多糖產(chǎn)率。

    1.2 理化形式分析

    1.2.1 總糖含量的測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。首先,在干燥的100 mL容量瓶中準(zhǔn)確稱量18.80 mg無水葡萄糖,加水溶解并稀釋至刻度處,充分搖勻,然后在50 mL容量瓶中準(zhǔn)確吸取10 mL葡萄糖溶液,加蒸餾水至刻度線標(biāo)記處,充分搖動(dòng),得到 0.037 6 mg/mL 無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別精確量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mL葡萄糖參比溶液(濃度)于干燥的試管中,每管補(bǔ)加蒸餾水至0.5 mL。每管再加入300 μL 6%苯酚溶液,充分搖勻后再次加入1.5 mL濃硫酸溶液(濃度),振蕩搖勻后在沸水浴中充分反應(yīng) 15 min,再取出混合物,并置于冰浴中冷卻至室溫,通過測(cè)定推導(dǎo)出回歸方程。

    樣品的測(cè)定:將多種樣品配制成5 mg/mL水溶液備用,再精確移取0.2 mL水溶液,按上述操作分別測(cè)量樣品,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

    1.2.2 還原糖含量的分析 將各種樣品制備成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的水溶液,分別精確移取1.0 mL水溶液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中,加蒸餾水定容。然后精確移取2.5 mL稀釋后的供試樣品溶液至容量瓶中,準(zhǔn)確加入2.5 mL DNS試劑,充分混勻,沸水浴加熱5 min后,用冷流水冷卻,將體積調(diào)節(jié)至標(biāo)記線處(25 mL),以去離子水作為空白對(duì)照組,測(cè)量其在540 nm處的吸光度。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其還原糖含量。

    1.2.3 總酚含量的分析 精確量取5 mL各種供試品溶液于干燥試管中,再加入5 mL福林酚試劑,搖勻后在室溫下放置3 min。再次加入5 mL 10%碳酸鈉溶液,充分搖勻后在室溫下顯示1 h(使用相應(yīng)試劑作為空白對(duì)照),用紫外-可見分光光度法在 700 nm 處測(cè)量吸光度。以50 μg/mL沒食子酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,并根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其總酚含量。

    1.3 單糖組分分析

    由于在測(cè)定單糖組成前首先需要將多糖降解為單糖后才能測(cè)定,因此試驗(yàn)前準(zhǔn)確稱取5 mg已經(jīng)分離純化的油茶葉濾液、油茶葉粗多糖、茶耳濾液、茶耳粗多糖樣品,分別置于不同安瓿瓶中,加入 1 mL 濃度為2 mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液,使用乙醇噴燈封閉瓶口,將密封的安瓿瓶放到溫度為110 ℃的烘箱內(nèi)進(jìn)行水解反應(yīng)(反應(yīng)8 h使反應(yīng)完全)。等待水解反應(yīng)完全后,將樣品用甲醇溶液(濃度100%)溶解并轉(zhuǎn)移到不同雞心瓶?jī)?nèi),用甲醇溶液旋蒸多次,直至除去所有樣品中的TFA,并轉(zhuǎn)移至EP管中供以后使用,最后放置于40 ℃烘箱內(nèi)烘干。

    標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。分別準(zhǔn)確稱取干燥的甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcuA)、半乳糖醛酸(GalUA)、乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)和巖藻糖(Fuc)的單糖標(biāo)準(zhǔn)品,用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法對(duì)各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和油茶葉濾液、油茶葉粗多糖、茶耳濾液、茶耳多糖水解產(chǎn)物進(jìn)行衍生化,然后進(jìn)行高效液相色譜分析。

    試驗(yàn)條件:色譜柱為KP-C色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為磷酸緩沖鹽溶液(PBS,pH值=6.7)-乙腈(體積比=82 ∶18);流速為 1 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

    1.4 體外抗氧化能力的測(cè)定

    DPPH自由基清除率的測(cè)定。將油茶葉多糖和茶耳多糖分別配制成濃度為0、2、4、6、8、10 mg/mL的水溶液。將油茶葉多糖(HE)、茶耳多糖(IE)水提液分別配制成0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL水溶液,然后吸取250 μL 0.02% DPPH-甲醇(DPPH為1,1-二苯基-2-硝基苯肼)溶液加到 1 mL 樣品水溶液中。在室溫下避光放置 30 min 后,以維生素C作為陽性對(duì)照,在517 nm處測(cè)量其混合物的吸光度。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下:

    DPPH自由基清除率=517 nm()-517 nm()/517 nm()×100%。

    式中:517 nm()為樣品的吸光度;517 nm()為空白樣品的吸光度。

    羥基自由基清除率的測(cè)定。將多糖分別配制成質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10 mg/mL的水溶液。將水提液HE、IE分別配制成質(zhì)量濃度為0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL的水溶液,吸取1 mL 9 mmol/L FeSO溶液和1 mL 9 mmoL/L水楊酸-甲醇溶液加入1 mL樣品水溶液中。混合后,向混合物中加入 1 mL 9 mmoL/L HO溶液。在37 ℃避光30 min后,以維生素C作為陽性對(duì)照,在517 nm處測(cè)量混合物的吸光度。其對(duì)羥基自由基清除率的計(jì)算公式如下:

    羥基自由基清除率=517 nm()-517 nm()/517 nm()×100%。

    式中:517 nm()為樣品的吸光度;517 nm()為空白樣品的吸光度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 油茶、茶耳水提物及多糖的提取

    本試驗(yàn)提取的油茶、茶耳水提物的顏色均為紅棕色,醇沉后的多糖為褐色粉末,油茶葉多糖的產(chǎn)率為16.9%,茶耳多糖的產(chǎn)率為10.24%,多糖的理化性質(zhì)分析結(jié)果見表1。通過分析健康油茶葉、被(shirai)Syd真菌寄生后油茶葉茶耳中多糖相關(guān)成分的性質(zhì)發(fā)現(xiàn),被感染葉片茶耳的總糖含量高于健康葉片,還原糖含量也顯著增加。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,真菌的寄生可以促進(jìn)一些糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,使被真菌寄生的葉片的含糖量比健康葉片高。通過比較總酚含量發(fā)現(xiàn),真菌的寄生可以提高葉片中的酚類物質(zhì)含量。

    表1 油茶、茶耳水提物及其各多糖成分含量 %

    2.2 油茶和茶耳水提物及多糖的單糖組成分析

    分析圖2至圖6可知,油茶葉多糖由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成,由其相對(duì)峰面積比可以看出,5種單糖的含量比例為 2.96 ∶5.83 ∶22.28 ∶19.71 ∶15.99。分析圖3、圖6可知,油茶葉水提液由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成,由其相對(duì)峰面積比可以看出,5種單糖的含量比例為0.85 ∶9.80 ∶71.86 ∶4.10 ∶3.63。分析圖4、圖6可知,茶耳多糖由甘露糖(Man)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)4種單糖組成,由其相對(duì)峰面積比可以看出,4種單糖的含量比例為23.81 ∶20.71 ∶22.88 ∶6.74。分析圖5、圖6可以看出,茶耳水提液由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成,由其相對(duì)峰面積比可以看出,5種單糖的含量比例為 5.54 ∶3.80 ∶63.73 ∶6.83 ∶3.25。

    通過比較茶耳多糖和油茶葉粗多糖的單糖組分發(fā)現(xiàn),茶耳多糖的甘露糖含量明顯高于油茶葉多糖,并且茶耳多糖組分中沒有油茶葉多糖的氨基葡萄糖成分。

    2.3 油茶和茶耳水提物及多糖的抗氧化活性

    由圖7至圖10可以看出,油茶葉、茶耳水提取物具有良好的抗氧化活性。本研究分析了油茶葉、茶耳、油茶葉水提液和茶耳水提液對(duì)DPPH自由基的清除活性,并將其與陽性對(duì)照抗壞血酸進(jìn)行了比較。由結(jié)果可知,茶葉水提液、茶耳水提液對(duì)DPPH自由基的清除效果都明顯優(yōu)于多糖。茶葉提取物、茶耳提取物清除DPPH自由基的EC分別為0.07、0.03 mg/mL(圖8)。水提取物具有良好的抗氧化活性,可能與其內(nèi)部酚類物質(zhì)含量豐富有關(guān)。茶耳粗多糖、油茶葉粗多糖清除DPPH自由基的EC分別為4.7、3.4 mg/mL (圖7)。通過圖9、圖10比較茶葉水提液和茶耳水提液對(duì)羥自由基的清除活性,并與油茶葉多糖和茶耳多糖進(jìn)行了比較。由結(jié)果可知,油茶葉多糖、茶耳多糖具有弱的羥自由基清除作用。研究結(jié)果表明,真菌的寄生會(huì)提升葉片提取物的體外抗氧化能力。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)從油茶葉和茶耳中提取水提物與活性多糖,分析其單糖組成及化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明,真菌寄生后茶葉中的總糖、還原糖和總酚含量均有增加。本研究結(jié)果表明, 真菌可以將油茶葉片中的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類、酚類物質(zhì)。將茶葉水提液和茶耳水提液、茶葉多糖和茶耳多糖的體外抗氧化能力進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),真菌寄生后可以使葉片提取物的抗氧化能力顯著增強(qiáng),可以為市場(chǎng)上油茶葉真菌污染問題提供一些解決方法,同時(shí)可對(duì)一些真菌污染后的油茶葉進(jìn)行處理以開發(fā)一些茶飲料,減少經(jīng)濟(jì)損失。

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