• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同處理方式對鮮切天麻貯藏軟化相關(guān)酶表達(dá)的影響

    2022-09-23 12:00:06孫海燕郝丹青裴金金李新生
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年17期
    關(guān)鍵詞:涂膜茶多酚天麻

    孫海燕, 田 蕓, 郝丹青, 王 瑞, 裴金金, 陳 琛, 李新生,2

    (1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000; 2.陜西理工大學(xué)/陜西省資源生物重點(diǎn)實驗室,陜西漢中 723000;3.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心秦巴地區(qū)保鮮工作站,陜西漢中 723000;4.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,貴州貴陽 550000)

    天麻(Bl.)又稱赤箭、離母、神草等,屬于蘭科植物,廣泛分布于秦巴山區(qū),是一種傳統(tǒng)的名貴中藥材。天麻的主要有效成分是天麻素及其苷元、天麻多糖,對頭痛失眠等癥狀有較好的治療作用。目前,天麻主要作為藥材使用,在市面上以干品居多,新鮮樣品較少,這是因為天麻的采收時間較短,新鮮天麻容易潰爛,不易保鮮,一般僅可自然放置5~7 d。傳統(tǒng)的天麻貯藏大多采用保鮮劑、真空包裝、低溫冷藏等方法,在一定程度上可以延長天麻的保鮮時間。目前,國內(nèi)外對天麻保鮮的研究較少,國內(nèi)已有的報道主要集中于鮮食天麻貯藏工藝及鮮食天麻與傳統(tǒng)干制天麻貯藏方法的比較,也有一些報道是關(guān)于天麻失質(zhì)量率、可食率、口感、硬度、色度等進(jìn)行的研究。至今,天麻軟化相關(guān)酶是否會影響其后續(xù)保鮮效果尚仍不清楚。天麻在采收后仍具有活性,在其貯藏期間會逐漸軟化,活性物質(zhì)會被降解,不利于保鮮;天麻軟化是一個非常復(fù)雜的發(fā)育調(diào)控過程,包含一些生理生化反應(yīng),包括細(xì)胞壁的降解、內(nèi)含物的變化、呼吸速率的變化等,可能有多種軟化相關(guān)酶參與調(diào)控。果膠裂解酶(PL)是一種通過降解果膠使果實軟化的酶,可以隨機(jī)裂解高等植物的中膠層和初生細(xì)胞壁,主要功能是在果實成熟過程中參與果膠結(jié)構(gòu)的裂解以達(dá)到軟化果實的目的;果膠甲酯酶(PME)能夠催化細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸的脫甲酯化,可以使植物細(xì)胞壁中的果膠多糖降解;過氧化物酶(POD)隸屬于氧化還原酶類,廣泛分布于大自然中,是造成植物木質(zhì)化的關(guān)鍵酶之一;木瓜蛋白酶主要存在于番木瓜中,是一種催化活性很強(qiáng)的蛋白水解酶;組織蛋白酶是蛋白酶類的一種,其主要功能是降解蛋白質(zhì)。

    本研究所用天麻取自陜西省漢中市南鄭縣青樹鎮(zhèn),采收當(dāng)天運(yùn)回實驗室,篩選無損傷且大小均一的天麻。成熟天麻為黃褐色塊莖,取新鮮天麻,清洗干凈后切成塊狀,采用茶多酚涂膜、超高壓處理、茶多酚涂膜+超高壓處理3種方式處理,用聚乙烯保鮮袋保存于4 ℃冰箱中,以備后續(xù)試驗使用。本試驗以3種不同處理方式處理的天麻樣品為材料,首先進(jìn)行表型分析,然后提取樣品RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后用qPCR檢測天麻軟化調(diào)控相關(guān)酶的表達(dá)規(guī)律,為進(jìn)一步從分子水平揭示天麻軟化機(jī)制和保鮮效應(yīng)奠定研究基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    2019年3月于陜西省漢中市略陽縣采挖新鮮天麻,當(dāng)天運(yùn)回實驗室后,用清水清洗、晾干、去皮后切成1 cm厚的片狀,用3種不同方式處理(茶多酚涂膜、超高壓、茶多酚涂膜+超高壓)后,各個處理均稱取(250±2) g裝入聚乙烯塑料袋中,封口后存放于4 ℃冰箱中。

    1.2 主要試劑及儀器

    總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、qPCR試劑盒、SYBR Premix Ex[寶生物工程(大連)有限公司,TaKaRa];三氯甲烷、異丙醇、75%冷乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)水[上??评噭┯邢薰綸;TRIzol(西安熱默爾生物科技有限公司)。PCR擴(kuò)增儀(美國伯樂公司)、恒溫水浴鍋(上海精密儀器儀表有限公司)、離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、電子分析天平(奧豪斯公司)、蛋白核酸分析儀(美國Thermo公司)、電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司)、凝膠成像(英國Syngene公司)等。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 樣品處理 選取新鮮天麻,分別用3種方式(茶多酚涂膜、超高壓、茶多酚涂膜+超高壓)進(jìn)行處理。(1)茶多酚涂膜。在新鮮天麻表面均勻噴涂1.5%茶多酚保鮮液,陰涼避光處晾干后,裝入聚乙烯袋中保存。(2)超高壓處理。將新鮮天麻裝入聚乙烯袋中,封口后在20 ℃、300 MPa條件下超高壓處理10 min。(3)茶多酚涂膜+超高壓處理。在新鮮天麻表面均勻噴涂1.5%茶多酚保鮮液后,于陰涼避光處晾干,再將其裝入聚乙烯袋內(nèi),封口后在20 ℃、300 MPa條件下超高壓處理10 min。

    1.3.2 取樣及表型觀察 每7 d取樣1次,每次取出2片鮮切天麻,觀察樣品表型差異并拍照記錄。再將樣品切成小塊,用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。

    1.3.3 RNA的提取 提取用不同方式處理的天麻樣品RNA的具體步驟如下:(1)取2 mL離心管,加入1 mL TRIzol,將試驗樣品和研缽(160 ℃滅菌)從-80 ℃冰箱中取出,先向研缽中加入液氮預(yù)冷,再將樣品放入研缽中研磨,邊研磨邊補(bǔ)充液氮,研磨至粉末狀,用藥匙將粉末加入離心管中,做好標(biāo)記;(2)室溫靜置10 min使粉末充分裂解,于12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min,去除組織碎片,小心吸取上清(紅色)至新的2 mL離心管中;(3)向離心管中加入 200 μL 三氯甲烷(TRIzol體積的1/5),蓋緊離心管蓋,劇烈振蕩15 s,待液體充分乳化后,冰上靜置 5 min,于12 000 r/min、4 ℃離心15 min;(4)從離心機(jī)中取出離心管,此時勻漿分為3層,上層為無色水相上清(RNA所在層),中間層為白色蛋白層,下層為有機(jī)層,小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中并做好標(biāo)記,勿吸取白色中間層;(5)向上清液中加入與上清液等體積的異丙醇,上下輕柔顛倒,于室溫靜置10 min;(6)于12 000 r/min、4 ℃離心10 min;(7)輕輕倒掉上清液,沿離心管壁緩慢加入1 mL 75%預(yù)冷乙醇(提取RNA專用),輕輕上下顛倒洗滌沉淀,于12 000 r/min、4 ℃離心5 min,小心倒掉75%乙醇;(8)室溫下干燥沉淀2~5 min,待乙醇完全揮發(fā)后,加入60 μL DEPC水溶解沉淀;(9)用核酸定量儀測定RNA濃度,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.4 RNA反轉(zhuǎn)為cDNA 參照PrimeScript(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成相應(yīng)的cDNA。1 μL gDNA Eraser,2 μL 5×gDNA Eraser Buffer,1 μL樣品RNA,補(bǔ)加Rnase Free dHO至10 μL,于42 ℃水浴2 min,即可得到消除基因組的DNA體系。在上述體系中,加入Reaction solution from Step 1 10 μL,5×Primerscript Buffer 2 4 μL,Primerscripr Mix 1 μL,RT Primer Mix 1 μL,Rnase Free ddHO 4 μL,渦旋混勻,置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃保存。

    1.3.5 引物的設(shè)計 為了篩選天麻中的軟化酶,本研究在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中查閱相關(guān)文獻(xiàn),以了解軟化相關(guān)酶的種類,由于天麻軟化相關(guān)酶基因在NCBI數(shù)據(jù)庫上未見公布,因此選取與其同科植物的相關(guān)基因序列,用BLAST進(jìn)行比對,選取高度保守的序列,結(jié)合引物設(shè)計的原則,用Primer 5.0軟件,每個基因設(shè)計2~3對引物,共設(shè)計22對引物。

    1.3.6 通過普通PCR法篩選引物 以cDNA為模板,按照PCR反應(yīng)體系將所需試劑依次加入PCR管中,具體反應(yīng)體系為0.6 μL模板DNA,7.5 μL Mix,0.7 μL上游引物,0.7 μL下游引物,5.5 μL滅菌水,總體積15 μL。反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性 2 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)34次;72 ℃ 延伸30 s,72 ℃充分延伸10 min,12 ℃保存。

    1.3.7 Real-time qPCR檢測軟化相關(guān)酶編碼基因的mRNA表達(dá)水平 Real-time qPCR的具體操作參照TaKaRa的說明書,每個基因做3個重復(fù),20 μL 反應(yīng)體系:10 μL SYBR,1.6 μL上游引物(10 μmol/L),1.6 μL下游引物(10 μmol/L),2 μL cDNA模板,4.8 μL ddHO。采用兩步法PCR反應(yīng)程序,具體反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,循環(huán)50次;95 ℃延伸 15 s,72 ℃充分延伸10 min,12 ℃保存。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    用Excel 97-2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并分析結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 天麻保鮮過程中的表型分析

    本試驗每隔7 d取樣1次,同時拍照記錄樣品的表型。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),天麻在保鮮過程中的表型變化具有以下特征:(1)天麻在自然條件下(空白對照組)逐漸變軟,顏色由白色變成淡黃色;(2)經(jīng)茶多酚涂膜的天麻顏色與空白組相比差異不顯著,用刀不易切開;(3)經(jīng)過超高壓處理的天麻整體變脆,很容易用小刀切成塊狀,且有汁液流出;(4)用茶多酚涂膜并進(jìn)行超高壓處理的天麻水分較多,取樣后袋中有較多汁狀液體殘余,相較于其他3種處理方式樣品的顏色更深(圖1)。

    2.2 RNA質(zhì)量的檢測

    為了檢測RNA的質(zhì)量,隨機(jī)選取部分RNA樣品,并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖2可以看出,所有樣品總RNA的28S、18S RNA主峰單一、清晰無降解,說明提取的RNA質(zhì)量較好,可用于后續(xù)研究。

    2.3 引物的篩選

    由于在NCBI等數(shù)據(jù)庫中未檢索到天麻軟化相關(guān)酶的編碼基因序列,因此本試驗選取多個與天麻同科或同種植物軟化相關(guān)酶的編碼基因序列,經(jīng)BLAST軟件比對,選取高度保守序列,結(jié)合引物設(shè)計原則,用Primer 5.0工具,每個基因設(shè)計2~3對引物,共設(shè)計22對引物,其中為內(nèi)參基因引物,引物序列見表1。

    表1 天麻軟化表達(dá)酶相關(guān)基因引物

    用PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,由圖3、圖4可以看出,只有組織蛋白酶(Cathepsin)和過氧化物酶(POD)擴(kuò)增出相應(yīng)條帶,其他引物均未檢測到條帶。

    2.4 天麻軟化相關(guān)酶的表達(dá)趨勢

    以空白樣(處理0 d)為對照進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,并繪制成折線圖。由圖5可以看出,28 d前,PL、Cathepsin這2種酶的編碼基因的mRNA水平變化趨勢一致,都是先升后降;PME則前期出現(xiàn)一個快速下降的趨勢;Papain的表達(dá)水平為先升高再降低;POD相對表達(dá)量在處理28 d前與Papain相對表達(dá)

    量變化趨勢相似,但在處理28 d后則迅速升高。

    2.5 PL編碼基因的相對表達(dá)量

    本試驗通過qPCR檢測PL基因的mRNA相對表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PL在所有天麻樣品中都有表達(dá),經(jīng)過茶多酚涂膜的樣品,其PL的相對表達(dá)量明顯低于空白組;用超高壓處理的天麻樣品,在處理14 d時PL的表達(dá)量顯著低于空白組,但是隨著保鮮時間的增加,PL的相對表達(dá)量明顯升高;用茶多酚涂膜+超高壓處理的天麻樣品,在處理14 d時的表達(dá)量極顯著高于空白對照組,并且隨著保鮮時間的增加,其表達(dá)量迅速降低(處理21 d左右),之后有所上升,但表達(dá)水平的變化差異不明顯(表2)。

    表2 PL的mRNA相對表達(dá)量

    2.6 PME編碼基因的相對表達(dá)量

    果膠甲酯酶可以降解植物細(xì)胞壁中的果膠,在植物中普遍表達(dá)。在處理時間為14 d時,茶多酚涂膜的天麻樣品中PME的表達(dá)量低于空白對照組,而在處理時間超過35 d后則高于空白對照組;經(jīng)茶多酚涂膜+超高壓處理的樣品在處理前21 d均低于空白對照組,在處理35 d時略有升高;超高壓處理樣品PME的相對表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(表3)。

    表3 PME的mRNA相對表達(dá)量

    2.7 POD編碼基因的相對表達(dá)量

    過氧化物酶具有抗氧化性,經(jīng)qRCR檢測發(fā)現(xiàn),處理14 d時,3種不同處理方式的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量均低于空白對照組,但在處理21 d時,經(jīng)超高壓處理的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量極顯著高于空白對照組,其他2種則與空白組差異不大;在處理28 d時,天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量均高于空白組,且茶多酚涂膜的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量提高了20倍;在處理35 d時,茶多酚涂膜、超高壓處理的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量顯著低于空白對照組,而茶多酚涂膜+超高壓處理的天麻樣品中POD的相對表達(dá)量與空白組略接近(表4)。

    表4 POD的mRNA相對表達(dá)量

    2.8 Papain編碼基因

    為了分析Papain在天麻軟化過程中的表達(dá)情況,用qPCR檢測Papain編碼基因的表達(dá)水平。由表5可以看出,茶多酚涂膜處理的天麻樣品的Papain編碼基因相對表達(dá)量在處理前28 d均低于空白組,但在處理35 d后則略高于空白組;在超高壓處理下,天麻樣品的Papain編碼基因的相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組,在處理35 d時提高到處理7 d時的437倍左右;在茶多酚涂膜+超高壓處理下,天麻樣品的Papain編碼基因相對表達(dá)量在處理 14 d 時高于空白對照組,但在處理21 d時迅速降低,隨后又緩慢提高,但都低于對照。

    表5 Papain的mRNA相對表達(dá)量

    2.9 Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量

    Cathepsin的主要功能是降解蛋白質(zhì),經(jīng)qPCR檢測發(fā)現(xiàn),茶多酚涂膜處理的天麻樣品Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量始終低于空白對照組;在超高壓處理下,天麻樣品的Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量先升高后降低,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組;在茶多酚涂膜+超高壓處理下,天麻樣品的Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量在處理14 d時提高到處理7 d時的103倍,在處理21 d時提高至處理7 d時的8倍;在處理35 d時上升到處理7 d時的232倍(表6)。

    表6 不同處理時間Cathepsin的mRNA相對表達(dá)量

    3 討論

    近年來,關(guān)于天麻保鮮的研究主要集中在生理生化指標(biāo)測定方面,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,相關(guān)研究正逐步向生物技術(shù)靠攏。大量研究發(fā)現(xiàn),果蔬的軟化與細(xì)胞壁有密切關(guān)系,植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素、果膠,而高等植物細(xì)胞壁中果膠含量較高,是植物細(xì)胞間質(zhì)的重要成分,因此,與植物細(xì)胞壁有關(guān)的酶與天麻的軟化程度密切相關(guān)。目前關(guān)于天麻軟化相關(guān)酶的報道較少,本試驗選取與天麻同科或同屬植物軟化相關(guān)酶的基因序列,用BLAST進(jìn)行序列比對,選取高度保守的序列,用Primer 5.0工具,每個基因設(shè)計2~3對引物,共設(shè)計22對引物,經(jīng)過普通PCR擴(kuò)增篩選及qPCR篩選,最終選取PL、PME、Papain、POD和Cathepsin等5種軟化酶進(jìn)行分析,分別在3種不同包裝方式的天麻樣品中檢測了上述軟化酶的表達(dá)差異。在天麻軟化過程中,這5個基因的mRNA表達(dá)水平均受到影響,果膠裂解酶在經(jīng)茶多酚涂膜后表達(dá)量顯著降低,說明這種處理方式抑制了PL的表達(dá),保鮮效果較好;而在經(jīng)過3種不同包裝方式處理后,PME的表達(dá)水平變化以顯著為主,說明PME的表達(dá)可能不受這3種包裝方式的影響;經(jīng)3種不同方式處理的天麻樣品貯藏35 d時POD的相對表達(dá)量均低于空白組,說明POD減緩了天麻的氧化程度,具有較好的保鮮效果;經(jīng)超高壓處理后,Papain的相對表達(dá)量升高,說明經(jīng)過這種方式促進(jìn)了Papain的表達(dá),天麻軟化程度加深,但經(jīng)過茶多酚涂膜+超高壓處理后的天麻Papain的相對表達(dá)量比超高壓處理的天麻的表達(dá)量低,進(jìn)一步說明茶多酚涂膜的保鮮效果較好;茶多酚涂膜的天麻樣品種組織蛋白酶的相對表達(dá)量始終低于空白組,而其他處理方式的Cathepsin相對表達(dá)量升高,說明茶多酚涂膜有利于天麻的保鮮。綜上所述,茶多酚對天麻保鮮的效果較好,而超高壓處理反而促進(jìn)了天麻的軟化,推測可能是超高壓處理時的溫度、壓強(qiáng)和處理時間不佳造成的;在分子水平上,天麻軟化過程是由多個基因共同調(diào)控的,而本試驗僅選取且研究了一小部分基因,不能夠完全展現(xiàn)天麻在保鮮過程中的軟化調(diào)控機(jī)制,天麻的軟化相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探索,本試驗的結(jié)果可為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ),為天麻保鮮研究提供參考。

    猜你喜歡
    涂膜茶多酚天麻
    神奇的天麻
    大自然探索(2024年1期)2024-02-29 09:10:34
    茶多酚的抗氧化性及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用
    湖南飼料(2021年3期)2021-07-28 07:06:06
    你知道食天麻會引起“藥駕”嗎?
    如何了解涂膜料的基本性能
    塑料包裝(2021年3期)2021-01-25 09:22:12
    天麻無根無葉也能活
    腸道微生物與茶及茶多酚的相互作用在調(diào)節(jié)肥胖及并發(fā)癥中的作用
    基于HPLC-ESI-TOF/MS法分析測定烏天麻和紅天麻中化學(xué)成分的研究
    茶多酚的提取
    納米TiO2與SiO2改性PVA基復(fù)合涂膜研究
    應(yīng)用轉(zhuǎn)盤塔逆流萃取器從夏秋季次品茶中制備茶多酚
    韩国高清视频一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av.在线天堂| 久久女婷五月综合色啪小说| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 伊人久久国产一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 身体一侧抽搐| 少妇人妻 视频| 久久久久久久精品精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产在线一区二区三区精| 蜜桃在线观看..| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久久久久伊人网av| 精品少妇久久久久久888优播| 一级黄片播放器| 成年女人在线观看亚洲视频| 欧美最新免费一区二区三区| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本爱情动作片www.在线观看| 国精品久久久久久国模美| 青青草视频在线视频观看| 久久97久久精品| 国产片特级美女逼逼视频| 秋霞在线观看毛片| 久久久色成人| 视频中文字幕在线观看| 综合色丁香网| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 国产 精品1| 乱系列少妇在线播放| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 最黄视频免费看| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品无大码| 日本午夜av视频| 国产成人精品一,二区| 国产乱人偷精品视频| 成人一区二区视频在线观看| 18+在线观看网站| 22中文网久久字幕| 精品午夜福利在线看| 日韩免费高清中文字幕av| 国产乱人偷精品视频| 国产成人精品福利久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日韩在线观看h| 国产精品三级大全| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 我的女老师完整版在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 五月天丁香电影| 大码成人一级视频| 久久久久久久久久久免费av| 大香蕉久久网| 九九在线视频观看精品| 一个人看的www免费观看视频| 制服丝袜香蕉在线| 三级国产精品欧美在线观看| 男人舔奶头视频| 亚洲天堂av无毛| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品一及| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 99九九线精品视频在线观看视频| 免费大片黄手机在线观看| 国产久久久一区二区三区| 久久久久久人妻| 欧美高清性xxxxhd video| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av成人精品一区久久| 网址你懂的国产日韩在线| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲av男天堂| 国产精品av视频在线免费观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久午夜欧美精品| 一级黄片播放器| 国产黄色视频一区二区在线观看| 在线 av 中文字幕| 国产 精品1| 欧美高清性xxxxhd video| 国产久久久一区二区三区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产伦精品一区二区三区四那| 伦精品一区二区三区| 国产av码专区亚洲av| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 七月丁香在线播放| 青青草视频在线视频观看| 亚洲综合精品二区| 国产视频内射| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久久精品免费免费高清| 在线观看av片永久免费下载| 国国产精品蜜臀av免费| 日韩一区二区三区影片| 国产探花极品一区二区| 26uuu在线亚洲综合色| 男男h啪啪无遮挡| 国产乱人偷精品视频| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲欧洲日产国产| 一级黄片播放器| 99国产精品免费福利视频| 久久精品国产自在天天线| 国产免费视频播放在线视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 天堂中文最新版在线下载| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 99热这里只有是精品在线观看| 99国产精品免费福利视频| 成人国产麻豆网| 亚洲综合精品二区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 男人舔奶头视频| 精品少妇久久久久久888优播| 高清毛片免费看| 亚洲第一区二区三区不卡| 一级a做视频免费观看| 一级黄片播放器| 国产在线视频一区二区| 日韩制服骚丝袜av| av不卡在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看 | 激情 狠狠 欧美| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲成色77777| xxx大片免费视频| 亚洲精品第二区| 久久久久久久久久成人| 草草在线视频免费看| 一本一本综合久久| 午夜视频国产福利| 国产真实伦视频高清在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 高清在线视频一区二区三区| 国产高潮美女av| 欧美性感艳星| 内地一区二区视频在线| 寂寞人妻少妇视频99o| a级毛片免费高清观看在线播放| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品.久久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲国产色片| 麻豆成人av视频| 草草在线视频免费看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 97超碰精品成人国产| 午夜免费观看性视频| 亚洲精品,欧美精品| 嫩草影院入口| 日韩视频在线欧美| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| av在线老鸭窝| 日日啪夜夜撸| 嫩草影院入口| 久久婷婷青草| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产免费视频播放在线视频| 中文字幕久久专区| 一区二区三区精品91| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲人成网站高清观看| 久久久亚洲精品成人影院| 嫩草影院新地址| 精品亚洲成a人片在线观看 | 亚洲人成网站在线播| 国产av精品麻豆| 日韩制服骚丝袜av| 最黄视频免费看| 国产免费福利视频在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲精品国产成人久久av| 春色校园在线视频观看| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 1000部很黄的大片| 国产成人91sexporn| 黄色怎么调成土黄色| 97精品久久久久久久久久精品| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 色5月婷婷丁香| 91久久精品电影网| 久久久久久久久大av| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲人成网站在线播| av在线蜜桃| 午夜免费鲁丝| av在线老鸭窝| 中文欧美无线码| videossex国产| av视频免费观看在线观看| 最新中文字幕久久久久| 水蜜桃什么品种好| 看十八女毛片水多多多| 少妇的逼好多水| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲av日韩在线播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 午夜福利高清视频| 亚洲色图综合在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 看非洲黑人一级黄片| 老司机影院成人| 伊人久久精品亚洲午夜| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品一区二区性色av| 一区二区三区四区激情视频| 日韩电影二区| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 久久久久久九九精品二区国产| 国产高清有码在线观看视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 嫩草影院入口| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产精品一及| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本av手机在线免费观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 婷婷色综合大香蕉| 乱系列少妇在线播放| 亚洲av二区三区四区| 国产亚洲最大av| 乱码一卡2卡4卡精品| 一区二区三区精品91| 一本一本综合久久| 久久久久久久久久久免费av| 搡老乐熟女国产| 97在线人人人人妻| 街头女战士在线观看网站| 在线 av 中文字幕| 亚洲成色77777| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产大屁股一区二区在线视频| av在线观看视频网站免费| 高清欧美精品videossex| 内射极品少妇av片p| 少妇的逼好多水| 国产乱人偷精品视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久国产网址| 欧美另类一区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 只有这里有精品99| 在线 av 中文字幕| av天堂中文字幕网| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产淫语在线视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 三级国产精品片| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美成人a在线观看| 97超碰精品成人国产| 精品午夜福利在线看| 久久久久久人妻| 一区二区三区精品91| 亚洲精品日本国产第一区| av福利片在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 赤兔流量卡办理| av又黄又爽大尺度在线免费看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品福利在线免费观看| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 熟女av电影| 午夜激情久久久久久久| 伊人久久国产一区二区| av国产免费在线观看| 99热全是精品| 我的老师免费观看完整版| 美女内射精品一级片tv| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产高清国产精品国产三级 | 天堂8中文在线网| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 联通29元200g的流量卡| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日日撸夜夜添| 性色avwww在线观看| kizo精华| 少妇人妻 视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲最大成人中文| 精品一品国产午夜福利视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 人妻一区二区av| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品一品国产午夜福利视频| 街头女战士在线观看网站| 在线观看免费高清a一片| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲av中文av极速乱| 久久精品久久精品一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产乱来视频区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 晚上一个人看的免费电影| 在线天堂最新版资源| 丰满乱子伦码专区| 国产精品伦人一区二区| 色综合色国产| 九色成人免费人妻av| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 好男人视频免费观看在线| a 毛片基地| 久久人人爽人人片av| 精品亚洲成a人片在线观看 | 一级片'在线观看视频| 成人无遮挡网站| 亚洲国产成人一精品久久久| 妹子高潮喷水视频| 女人久久www免费人成看片| 精品久久久久久久久av| 18禁动态无遮挡网站| 日韩欧美 国产精品| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产日韩欧美在线精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 中文字幕久久专区| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲国产最新在线播放| 高清视频免费观看一区二区| 草草在线视频免费看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 看免费成人av毛片| 日本vs欧美在线观看视频 | 成年av动漫网址| 男女边摸边吃奶| 91久久精品国产一区二区成人| 国产日韩欧美在线精品| 黄片无遮挡物在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 97超碰精品成人国产| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 九九在线视频观看精品| 欧美一区二区亚洲| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久韩国三级中文字幕| 中文资源天堂在线| 美女国产视频在线观看| 人妻系列 视频| av福利片在线观看| 一级毛片电影观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 男女啪啪激烈高潮av片| 美女内射精品一级片tv| 国产又色又爽无遮挡免| 日韩制服骚丝袜av| 99热这里只有是精品在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 黄片无遮挡物在线观看| 99久国产av精品国产电影| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产男女内射视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产视频首页在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩一区二区三区影片| 男女边摸边吃奶| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 制服丝袜香蕉在线| 精品久久久精品久久久| 五月开心婷婷网| 久久青草综合色| 99re6热这里在线精品视频| 舔av片在线| 国产精品国产av在线观看| 一级片'在线观看视频| 国产成人精品一,二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美成人午夜免费资源| 边亲边吃奶的免费视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲天堂av无毛| 乱系列少妇在线播放| 大陆偷拍与自拍| 视频中文字幕在线观看| 联通29元200g的流量卡| 亚洲欧洲国产日韩| 少妇 在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产av国产精品国产| 少妇的逼水好多| 亚洲精品色激情综合| 免费黄网站久久成人精品| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费观看的影片在线观看| 五月开心婷婷网| 欧美一区二区亚洲| 亚洲在久久综合| 国产成人免费无遮挡视频| 国产男女超爽视频在线观看| 日本欧美国产在线视频| 日韩av不卡免费在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 五月伊人婷婷丁香| 又爽又黄a免费视频| 五月玫瑰六月丁香| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜免费鲁丝| 免费av不卡在线播放| 我要看黄色一级片免费的| 欧美精品一区二区大全| 青春草国产在线视频| 婷婷色综合大香蕉| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 五月开心婷婷网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品第二区| 日本色播在线视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久国产精品大桥未久av | 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费看光身美女| 少妇丰满av| 一个人免费看片子| 一级a做视频免费观看| 亚洲国产精品999| 91精品国产国语对白视频| 欧美日韩综合久久久久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日日啪夜夜撸| 熟妇人妻不卡中文字幕| 大码成人一级视频| 尾随美女入室| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美精品一区二区大全| 嘟嘟电影网在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| h视频一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 天美传媒精品一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久精品性色| av国产免费在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产欧美人成| 国产在线视频一区二区| 毛片女人毛片| 国产精品成人在线| 精品亚洲成a人片在线观看 | 国产黄片美女视频| 丝袜脚勾引网站| 国产 一区精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费av中文字幕在线| 久久久久久久久久成人| 最近手机中文字幕大全| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品久久久久久久久av| 国产欧美亚洲国产| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲av日韩在线播放| 国产视频内射| 美女国产视频在线观看| 蜜桃在线观看..| 六月丁香七月| 日韩人妻高清精品专区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲国产av新网站| 午夜免费观看性视频| 国精品久久久久久国模美| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人二区视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲性久久影院| 精品久久久精品久久久| 国产极品天堂在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 青春草亚洲视频在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 国产人妻一区二区三区在| 久久国产乱子免费精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人影院久久| 九九在线视频观看精品| 久久99热6这里只有精品| 久久久久久久久大av| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲av在线观看美女高潮| 一级毛片电影观看| 免费av不卡在线播放| 午夜激情福利司机影院| 日本vs欧美在线观看视频 | 日本与韩国留学比较| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久影院123| 国产av码专区亚洲av| 韩国高清视频一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩成人伦理影院| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 乱码一卡2卡4卡精品| 久久影院123| 高清午夜精品一区二区三区| 日本黄色片子视频| 国产精品人妻久久久影院| 欧美人与善性xxx| 热99国产精品久久久久久7| 国产真实伦视频高清在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 久久久久久久精品精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 香蕉精品网在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产成人freesex在线| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美bdsm另类| 欧美变态另类bdsm刘玥| 能在线免费看毛片的网站| av在线观看视频网站免费| 久久久a久久爽久久v久久| 色视频在线一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 中文字幕免费在线视频6| 97在线视频观看| 亚洲av二区三区四区| 秋霞在线观看毛片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产伦在线观看视频一区| 久久久色成人| 又大又黄又爽视频免费| 久久久欧美国产精品| 日韩欧美精品免费久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产精品专区欧美| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 91久久精品国产一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久久久久精品精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久国内精品自在自线图片| 日韩人妻高清精品专区| 国产亚洲一区二区精品| 26uuu在线亚洲综合色| 老女人水多毛片| 国产精品三级大全| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲成人手机| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产中年淑女户外野战色| 欧美日韩在线观看h| 直男gayav资源| 黑人高潮一二区| 蜜桃在线观看..| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 乱系列少妇在线播放| 国产精品无大码| 又爽又黄a免费视频| 色哟哟·www| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产淫片久久久久久久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久久久久久国产电影| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费看不卡的av| 国内精品宾馆在线| 亚洲美女视频黄频| 麻豆成人av视频| 水蜜桃什么品种好| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产成人精品福利久久| 久久精品国产亚洲网站| 欧美精品国产亚洲| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美丝袜亚洲另类|