呋喃唑酮代謝物人工抗原的制備與鑒定

吳 萌， 吳海濤， 圣志存， 陳曉蘭， 蘇棪華， 柳青青

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

呋喃唑酮(furazolidone)，學(xué)名3-(5-硝基糠醛縮氨基)-2-唑烷酮，又名痢特靈，屬于硝基呋喃類藥物，具有廣譜的抗菌作用；現(xiàn)代藥理毒理試驗(yàn)研究表明，呋喃唑酮在機(jī)體內(nèi)代謝周期短、易衰減，主要代謝物為3-氨基-2-唑酮(AOZ)，分子結(jié)構(gòu)式，結(jié)果見圖1-A，AOZ可與機(jī)體內(nèi)組織蛋白緊密結(jié)合，從而殘留數(shù)周，對(duì)人體具有潛在的致癌、致突變作用。因此，我國相關(guān)法規(guī)明確規(guī)定嚴(yán)禁動(dòng)物性食品中添加包括呋喃唑酮在內(nèi)的硝基呋喃類藥物。但在實(shí)際生產(chǎn)中，由于呋喃唑酮預(yù)防和治療細(xì)菌性感染效果顯著且價(jià)格低廉，所以仍存在非法使用的情況。因此，建立快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法自然尤為重要。由于呋喃唑酮衰減原因，研究者們大多以AOZ作為標(biāo)志物檢測(cè)呋喃唑酮是否非法使用。

目前，檢測(cè)呋喃唑酮代謝物AOZ殘留常用的方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，具有檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，但存在前樣處理復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本昂貴等問題，尤其不適合大批量樣品的快速篩查。免疫分析法因靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、樣品高通量及成本低等優(yōu)點(diǎn)也成為檢測(cè)呋喃唑酮代謝物的一種重要手段，其建立的關(guān)鍵是獲得免疫學(xué)特性優(yōu)良的抗體，而抗體獲得的前提條件為制備待測(cè)物的免疫原。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)于2020年12月于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院生物制藥技術(shù)實(shí)驗(yàn)室完成。SPF級(jí)BALB/c小鼠(6周齡，雌性)，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

2-NP-AOZ：純度≥99.9%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(BSA)：純度≥98%；雞卵清白蛋白(OVA)：純度≥98%，默克集團(tuán)(Merck)；BCA蛋白定量試劑盒、明膠封閉緩沖液、ELISA顯色液與終止液、HRP-羊抗小鼠二抗：生工生物工程(上海)股份有限公司；1×PBS(pH值7.2～7.4)緩沖液、1×PBST緩沖液(pH值7.2～7.4)：北京索寶來科技有限公司；乙腈、亞硝酸鈉：均為AR，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

DK-S11數(shù)顯水浴鍋，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；4800 Plus MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀，AB SCIEX 公司；3500BR全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；VE180垂直電泳儀，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 完全抗原的合成 采用重氮法合成呋喃唑酮代謝物AOZ的完全抗原，包括免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA。準(zhǔn)確稱取AOZ衍生物(2-NP-AOZ)5 mg，溶解于500 μL乙腈中，加入2 mL濃度為1 mol/L的鹽酸，攪拌，再加入2 mg鋅粉，振蕩混勻；水浴中加熱 20 min，取上清冷卻至4 ℃，獲得2-NP-AOZ還原液。1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)還原液pH值至1.0～2.0，加入2 mol/L亞硝酸鈉溶液，至淀粉碘化鉀試紙檢驗(yàn)呈灰藍(lán)色。將上述混合液逐滴加至1 mL含50 mg的0.01 mol/L BSA且pH值為7.4的PBS溶液中，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至8.5，避光條件下振蕩1 h，放置在4 ℃冰箱過夜。PBS透析4 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清，即為免疫原2-NP-AOZ-BSA。包被原2-NP-AOZ-OVA的制備方法同上，以O(shè)VA代替BSA。

1.3.2 完全抗原濃度的測(cè)定 采用BCA試劑盒法測(cè)定人工抗原的濃度。將試劑盒中BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液(5 mg/mL)以PBS稀釋成0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL，分別取稀釋好的BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)人工抗原各20 μL置于96孔板中，加入200 μL/孔 BCA工作液，混勻；37 ℃ 水浴保溫30 min。冷卻至室溫后，在酶標(biāo)儀中測(cè)定各孔的值。以標(biāo)準(zhǔn)組各管平均值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)人工抗原的濃度。

1.3.3 紫外掃描光譜鑒定合成的完全抗原 將2-NP-AOZ-BSA 和2-NP-AOZ-OVA稀釋至0.5 mg/mL，以BSA、OVA、2-NP-AOZ標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對(duì)照，在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)上述溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，記錄圖譜，根據(jù)人工抗原與2-NP-AOZ標(biāo)準(zhǔn)品和載體蛋白BSA(OVA)吸收峰的變化判斷偶聯(lián)效果。

1.3.4 SDS-PAGE鑒定合成的完全抗原 將待測(cè)品BSA、OVA、2-NP-AOZ-BSA與2-NP-AOZ-OVA均配制為0.5 mg/mL溶液，分別與5×SDS Loading Buffer按照5 ∶1體積比混合，煮沸 10 min。取煮沸后待測(cè)樣各20 μL加入上樣孔，經(jīng)10%分離膠分離；電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h后，脫色，至蛋白條帶清晰無雜色。根據(jù)條帶位置即蛋白泳動(dòng)速度判斷偶聯(lián)是否成功。

1.3.5 MALDI-TOF-MS鑒定合成的完全抗原 將2-NP-AOZ-BSA和2-NP-AOZ-OVA稀釋至1 mg/mL，經(jīng)脫鹽處理后分別與基質(zhì)溶液混合，BSA和OVA溶液作為對(duì)照。點(diǎn)靶，置于質(zhì)譜儀內(nèi)進(jìn)行激光掃描，獲取離子質(zhì)譜圖，根據(jù)樣品相對(duì)分子量判斷是否偶聯(lián)成功并計(jì)算偶聯(lián)比。偶聯(lián)比=(-)/，其中：表示相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.6 動(dòng)物免疫 選6只6周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠，4只以2-NP-AOZ-BSA為免疫原免疫；1只為空白對(duì)照，以PBS為免疫原免疫；1只為陰性對(duì)照，相同的條件下飼養(yǎng)。首次免疫時(shí)加入等量的弗氏完全佐劑混合，以50 μg/只多點(diǎn)皮下注射。第2、第3、第4次免疫時(shí)用等量的弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑與免疫原混勻；第5次免疫時(shí)不添加7 d后采血，37 ℃放置2 h后置于4 ℃過夜，3 000 r/min 離心10 min，收集上清，-20 ℃保存。

1.3.7 免疫血清效價(jià)的測(cè)定 采用間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)。將包被原2-NP-AOZ-OVA稀釋至2.5 μg/mL，以100 μL/孔包被于96孔ELISA板上，37 ℃孵育2 h；PBST洗板，3次后加入 250 μL/孔 1%明膠封閉液，37 ℃孵育2 h；PBST洗板，3次后加入倍比稀釋的多抗血清100 μL/孔，并設(shè)置陰性、空白對(duì)照，37 ℃孵育2 h；PBST洗板，3次后加入稀釋好的羊抗鼠酶標(biāo)二抗100 μL/孔，37 ℃ 孵育1.5 h；PBST洗板后，加入100 μL/孔 TMB顯色液，避光反應(yīng)10 min后加入終止液，50 μL/孔。酶標(biāo)儀上選定空白對(duì)照后，測(cè)定值，待測(cè)孔為，陰性對(duì)照為，當(dāng)≥02且≥2.1 時(shí)，判定為陽性。

1.3.8 免疫血清敏感性的測(cè)定 采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定AOZ免疫血清的敏感性。將2-NP-AOZ-OVA包被至ELISA板上，加入50 μL/孔不同質(zhì)量濃度的2-NP-AOZ標(biāo)準(zhǔn)品(1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625、7.813、3.906、1.953、0.000 ng/mL)和 50 μL/孔為1.0對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的多抗血清；最后一孔只添加50 μL的PBS，設(shè)置為空白對(duì)照。其他步驟見“1.3.7”節(jié)。以(代表不同質(zhì)量濃度 2-NP-AOZ標(biāo)準(zhǔn)品孔的，代表2-NP-AOZ標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0時(shí)的)為縱坐標(biāo)，以2-NP-AOZ標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制抑制曲線，計(jì)算AOZ多抗的半數(shù)抑制濃度IC，并通過IC判斷抗體的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 完全抗原濃度的測(cè)定

由圖2可知，線性回歸方程式為=0912 4+0110 4，=0.996 1，計(jì)算人工抗原2-NP-AOZ-BSA濃度為4.9 mg/mL，2-NP-AOZ-OVA濃度為5.2 mg/mL。

2.2 完全抗原的紫外光譜掃描測(cè)定

由圖3-A可知，BSA在279 nm左右有最大吸收峰，2-NP-AOZ-BSA的特征性吸收峰相比BSA有一定程度的偏移，且與2-NP-AOZ的紫外光譜圖和趨勢(shì)不同，初步判斷2-NP-AOZ與BSA偶聯(lián)成功。

由圖3-B可知，2-NP-AOZ-OVA的紫光吸收曲線較OVA與2-NP-AOZ均發(fā)生明顯變化，初步判斷2-NP-AOZ與OVA偶聯(lián)成功。

2.3 完全抗原的SDS-PAGE鑒定

由圖4可知，相同條件下2-NP-AOZ-BSA的遷移速率小于BSA，2-NP-AOZ-OVA的遷移速率小于OVA，均出現(xiàn)了明顯的拖尾現(xiàn)象。說明2-NP-AOZ-BSA分子量明顯大于BSA，2-NP-AOZ-OVA分子量明顯大于OVA，推測(cè)BSA、OVA均成功偶聯(lián)了部分2-NP-AOZ，可初步判定免疫原與包被原合成成功。

2.4 完全抗原的MALDI-TOF-MS分析

由圖5可知，人工抗原2-NP-AOZ-BSA與 2-NP-AOZ-OVA相對(duì)分子量較載體蛋白相對(duì)分子量明顯增大，與SDS-PAGE顯示人工抗原比載體蛋白泳動(dòng)速度慢的結(jié)果一致，表明偶聯(lián)成功。由圖5-A可知，2-NP-AOZ-BSA的相對(duì)分子量為67 892.54，BSA的相對(duì)分子量為66 228.92；由圖 5-B 可知，2-NP-AOZ-OVA的相對(duì)分子量為 45 383.69，OVA的相對(duì)分子量為 44 484.31，根據(jù) 2-NP-AOZ相對(duì)分子量大小，得出2-NP-AOZ與BSA的偶聯(lián)比為7.1 ∶1，2-NP-AOZ與OVA的偶聯(lián)比為3.8 ∶1。

2.5 免疫血清效價(jià)的測(cè)定

由表1、表2可知，4只以2-NP-AOZ-BSA為免疫原進(jìn)行免疫的小鼠經(jīng)3次免疫后血清效價(jià)均達(dá)1 ∶16 000及以上；經(jīng)5次免疫后血清效價(jià)均達(dá) 1 ∶32 000 及以上。以2-NP-AOZ-OVA為包被原檢測(cè)小鼠血清，避免了血清中針對(duì)載體蛋白的抗原-抗體特異性反應(yīng)，表明以合成的免疫原免疫小鼠后產(chǎn)生了針對(duì)2-NP-AOZ的抗體，且隨著免疫次數(shù)增加，人工抗原免疫效果增強(qiáng)。

表1 3次免疫后小鼠血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果

表2 5次免疫后小鼠血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果

2.6 免疫血清敏感性的測(cè)定

以1號(hào)小鼠免疫血清為例，通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定免疫血清的敏感性。由圖6可知，2-NP-AOZ對(duì)小鼠免疫血清有抑制作用，其線性回歸方程式為=-0254+0890 3，為0.986 5，IC為34.43 ng/mL。免疫血清敏感性鑒定結(jié)果說明，2-NP-AOZ與載體蛋白成功偶聯(lián)，合成了免疫原性良好的人工抗原，該抗原能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，可產(chǎn)生敏感性較好的抗2-NP-AOZ的血清。

3 討論

免疫學(xué)認(rèn)為相對(duì)分子量小于1 000 u的分子僅具備反應(yīng)原性，無免疫原性。呋喃唑酮代謝物(AOZ)分子量為102，為典型小分子物質(zhì)，因此不能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，形成完全抗原后才具有免疫原性。本研究前期曾嘗試以AOZ直接連接載體蛋白BSA來生產(chǎn)制備抗體，但效果不理想，這與李敏等的結(jié)果一致；原因可能是AOZ分子量太小，直接偶聯(lián)載體蛋白會(huì)被蛋白質(zhì)分子包裹，不能形成有效的抗原表位，導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體免疫學(xué)特性較差，通常以AOZ衍生物(即在AOZ上連接1個(gè)間隔臂)代替AOZ合成人工抗原。相關(guān)研究表明，免疫效果與間隔臂有關(guān)，間隔臂長(zhǎng)度為3～6個(gè)碳為宜；除此之外，具有苯環(huán)的半抗原分子制備抗體的成功率為30%，而不含苯環(huán)則成功率僅為9%。溫丹華等選擇AOZ衍生物CP-AOZ合成人工抗原，制備抗體，建立免疫學(xué)檢測(cè)方法，與前人研究常用的AOZ衍生物不同，本研究選擇了同樣具有苯環(huán)的AOZ衍生物2-NP-AOZ合成人工抗原，原因是后期建立AOZ免疫學(xué)檢測(cè)方法時(shí)需要將檢測(cè)樣品衍生化，常得到的衍生化產(chǎn)物為2-NP-AOZ，且市面上有2-NP-AOZ的標(biāo)準(zhǔn)品而無CP-AOZ的標(biāo)準(zhǔn)品。

小分子與蛋白質(zhì)是否偶聯(lián)成功可用多種方法鑒定，如紫外吸收光譜法、紅外吸收光譜法、SDS-PAGE、核磁共振氫譜、質(zhì)譜等。由于2-NP-AOZ中含有可還原硝基，本研究采用重氮法分別與BSA和OVA偶聯(lián)獲得免疫原和反應(yīng)原；先通過SDS-PAGE判定偶聯(lián)效果，結(jié)果顯示，偶聯(lián)物的泳動(dòng)速度小于載體蛋白的泳動(dòng)速度，初步證明偶聯(lián)成功。然后通過MALDI-TOF-MS分析分子偶聯(lián)物和載體蛋白的分子量差別，判斷偶聯(lián)成功。Erlange研究發(fā)現(xiàn)，偶聯(lián)率3～25 ∶1比較合適；但也有學(xué)者認(rèn)為半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比對(duì)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生無決定性影響。本研究采用MALDI-TOF-MS分析法根據(jù)相對(duì)分子量差異計(jì)算偶聯(lián)比，簡(jiǎn)單快速且結(jié)果準(zhǔn)確，得出 2-NP-AOZ與BSA偶聯(lián)比為 7.1 ∶1，與OVA偶聯(lián)比為3.8 ∶1，均在適宜范圍內(nèi)。

半抗原與載體蛋白反應(yīng)合成的人工抗原，雖然從其分子結(jié)果已經(jīng)證明偶聯(lián)成功，但合成的免疫抗原是否具有免疫原性，最終必須通過免疫學(xué)試驗(yàn)來檢驗(yàn)。本研究以2-NP-AOZ-BSA為免疫原免疫小鼠，3次免疫后血清效價(jià)均達(dá)1 ∶16 000及以上，5次免疫后血清效價(jià)均達(dá)1 ∶32 000及以上，說明人工合成的抗原能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，具有良好的免疫原性，且免疫次數(shù)增多，免疫效果增強(qiáng)。

4 結(jié)論

本研究以AOZ的衍生物2-NP-AOZ分別偶聯(lián)BSA和OVA，制備免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA，經(jīng)紫外光譜掃描、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS分析初步判斷偶聯(lián)成功，偶聯(lián)率分別為7.1 ∶1和3.8 ∶1。將免疫原以50 μg/只免疫小鼠，3次和5次免疫后小鼠血清效價(jià)達(dá)1 ∶16 000及以上和1 ∶32 000及以上，合成的人工抗原具有良好的免疫原性。本研究完成了AOZ人工抗原的合成，為AOZ單克隆抗體的制備和免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。