叢枝菌根真菌對六堡茶茶葉品質及其相關基因表達的影響

馬 蕊， 林 勇， 馬婷婷

(1.廣西職業(yè)技術學院，廣西南寧 530226； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南長沙 410128)

茶樹[(L.) O. Kuntze]是世界范圍內(nèi)廣泛種植的食用性植物之一，主要以嫩葉為收獲對象，經(jīng)過加工的茶葉是廣受消費者喜愛的商品。茶樹主要種植于熱帶、溫帶的酸性土壤中，由于酸性土壤的特殊性質，其中的有效養(yǎng)分易產(chǎn)生鈍化作用，因此生長于酸性土壤的茶樹往往需要依靠與根系微生物相互作用，以更好地適應土壤環(huán)境中有限的養(yǎng)分供應。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是土壤系統(tǒng)中重要的功能性微生物。大量研究結果顯示，茶樹根圍存在大量AMF類群，以無梗囊霉屬()、根孢囊霉屬()、球囊霉屬()及斗管囊霉屬()為主。夏庭君等的研究結果表明，接種AMF可增加福鼎大白茶主根長、一級側根和三級側根數(shù)量，提高根系脫落酸、赤霉素及油菜素內(nèi)酯的含量。在鹽脅迫土壤中接種AMF可以促進茶樹對氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鎂(Mg)、鐵(Fe)和鋅(Zn)的吸收，降低水分飽和閾值、增強茶樹對鹽脅迫的耐受性、改善茶葉品質。此外，在酸性土壤中接種AMF可顯著增加實生茶苗、扦插茶苗的生物量累積，促進根系發(fā)育，提高葉片氨基酸、蛋白質、總多酚和咖啡堿等指標含量。以上研究結果表明，AMF可與茶樹形成良好的共關系，在提高茶樹生長發(fā)育、生理代謝及品質形成等方面具有良好的促進作用。

茶葉的化學組分包括糖分、茶多酚、可溶性總蛋白、兒茶素、氨基酸、總黃酮及揮發(fā)性物質等，同時也是評價茶葉品質的重要指標。相關酶類代謝是影響化學組分含量的重要樞紐，一般而言，環(huán)境因素、管理措施、生育時期及微生物定殖等皆可在一定程度上影響植物的酶類代謝。目前，眾多研究結果顯示，AMF可與茶樹形成良好的共生關系，AMF可影響宿主的次生代謝水平，從而提高茶葉的品質形成，然而目前尚不清楚接種AMF是否能夠調節(jié)氨基酸、黃酮及茶多酚等次生代謝物相關基因的表達水平?；诖?，本研究以六堡茶為材料，探索接種不同AMF及其組合處理對茶葉化學組分及相關代謝基因水平的影響，研究結果可為今后將菌根技術應用于茶樹栽培生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2021年4—7月于廣西壯族自治區(qū)梧州市六堡茶研究院塑料大鵬中進行，供試茶樹品種為六堡茶，種子來自梧州中茶茶業(yè)有限公司。將茶樹種子用0.5%次氯酸鈉(NaClO)進行初次消毒，接著用75%乙醇再次進行滅菌處理3 min，然后用流動無菌水小心沖洗。將表面滅菌的種子置于晝/夜溫度為28 ℃/30 ℃的環(huán)境中，在濕熱滅菌(121 ℃，1.1×10kPa，2 h)的細沙中培養(yǎng)25 d。

供試AMF分別為根內(nèi)根孢囊霉()、摩西斗管囊霉()及淺窩無梗囊霉()，這3株AMF來自廣西農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶資源研究所。菌株皆采用玉米、白三葉進行擴繁，試驗所用接種物由孢子(土中的含量為25個/g)、菌絲、根系殘體和土壤基質組成。

供試土壤取自梧州市六堡茶茶園(地理位置為23°39′49″E，111°35′25″N)的0～20 cm表層土壤。去除土壤中的植物殘體及砂石，經(jīng)自然風干后混勻，過2.5 mm網(wǎng)篩備用。供試土壤皆經(jīng)高壓濕熱滅菌(121 ℃，1×10kPa，2 h)以去除土壤土著AMF和其他微生物的干擾，反復滅菌1次，待土壤冷卻后混合備用。土壤類型為棕紅壤，其理化性質為pH值5.83，有機質含量19.25 g/kg，全氮含量1.16 g/kg，全磷含量0.41 g/kg，堿解氮含量101.06 g/kg，有效磷含量4.02 mg/kg，速效鉀含量117.69 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，設置5個接菌處理：單接種處理(RI)、單接種處理(FM)、單接種處理(AL)、混合接種++處理(MX)及不接種處理(CK)。各處理重復5次。

盆栽器具盆高15 cm，上口徑15 cm，底徑 13 cm，每盆裝土3 kg。4月17日將2葉期的茶樹幼苗轉移至盆栽土中，保持土壤的持水量在80%。接種AMF處理是將60 g AMF菌劑與滅菌的土壤混合，不接種處理僅加入經(jīng)高溫滅菌的菌劑。培養(yǎng)期間，每周轉動盆體1次，同時每2周隨機挪動1次盆體位置，以消除光照、通風等因素造成的試驗誤差。每2周向盆體中加入50 mL 0.5 mol/L Hoagland營養(yǎng)液且不定時加入適量蒸餾水。試驗于7月15日結束，共培養(yǎng)89 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 茶樹生物量、根系侵染率、總葉面積及株高的測定 培養(yǎng)結束后，將根系切成1 cm長的小段，參照Phillips描述的方法，采用臺盼藍染色、網(wǎng)格交叉記數(shù)法計算各處理的菌根侵染率。茶樹株高采用卷尺測量，葉面積使用葉面積儀(Li-3100C，Li-Cor，Biosciences，USA)進行測定。收獲全部盆栽植物，將茶樹全部取出，小心清洗根系后，將茶樹地上部、地下部分離，置于烘箱中殺青30 min，于 70 ℃ 烘干至恒質量并稱量，記錄生物量。

1.3.2 茶葉化學養(yǎng)分元素含量的測定 茶葉的P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn含量采用電感合成等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES，IRIS Advantage，Waltham，USA)測定，茶葉的氮(N)含量采用開氏法測定。

1.3.3 茶葉化學組分的測定 茶葉中多糖含量的測定參考傅博強等的步驟，采用水浸提-分光光度法。總可溶性蛋白含量的測定采用Folin酚試劑法，以牛血清白蛋白為標準品?？傤慄S酮含量的測定采用NaNO-Al(NO)-NaOH體系絡合化學吸光法。茶葉中總游離氨基酸含量的測定參考涂云飛的步驟，采用茚三酮法。茶葉中咖啡堿含量的測定參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》；茶葉中茶多酚及兒茶素含量的測定參考GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》。

1.3.4 茶葉品質相關酶基因的提取與測定 摘取每盆茶樹的上3張新鮮、幼嫩的葉片，迅速保存于 -80 ℃ 環(huán)境中。繞開主葉脈打孔，采用磁球珠對稱取的樣品進行快速研磨，用TaKaRa MiniBEST植物RNA提取試劑盒(TaKaRa Bio. Inc，Japan)提取樣本總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度與濃度。采用PrimeScriptRTreagent Kit gDNA(PK02006，TaKaRa Bio. Inc，Japan)構建互補基因文庫(cDNA)?；贕enBank數(shù)據(jù)庫中的茶樹相關基因，以作為看家基因，根據(jù)以上基因序列，借助Primer Express 5.0軟件設計擴增引物(表1)。將測量的轉錄本標準化為非AMF植物中的相對表達值，使用SYBR GREEN PCR Master Mix(Toyobo，Osaka，Japan)和Bio-Rad CFX96實時檢測系統(tǒng)，一式3份進行PCR定量復孔檢測。

qRT-PCR反應體系：8.8 μL ddHO，0.5 μL cDNA模板，5 μL天根2×PCR Mix，0.5 μL Rox，0.4 μL正向引物，0.4 μL反向引物。qRT-PCR反應參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)數(shù)。實時定量試驗結果采用斷層掃描，基于掃描系統(tǒng)的2-ΔΔ算法進行相對表達量的分析。

表1 qRT-PCR引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用Excel 2013進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 19.0進行單因素方差分析(ANOVA)，用鄧肯氏多重比較法進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析(=0.05)，用Origin 8.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 叢枝菌根真菌對六堡茶菌根侵染率及生長參數(shù)的影響

從表2可以看出，六堡茶樹根系可被根內(nèi)根孢囊霉、摩西斗管囊霉及淺窩無梗囊霉定殖，同時混合接種也存在共生結構，不同處理菌根的侵染率在22.74%～51.33%之間，且不同處理的菌根侵染率排序呈RI>MX>FM>AL，且兩兩處理間存在顯著差異，其中RI處理比其他處理高29%～126%。

從表2還可以看出，與未接種處理(CK)相比，接種處理(RI)的株高、總葉面積、地上部和根系的干物質含量分別顯著增加了44.25%、59.44%、94.09%和64.65%，接種處理(FM)的株高、總葉面積、地上部和根系的干物質含量分別顯著增加了42.25%、52.29%、70.97%和52.60%，混合接種處理(MX)的株高、總葉面積、地上部和根系的干物質含量則分別提高了38.42%、21.60%、60.22%和21.64%。而與CK處理相比，接種對上述植物生長指標皆存在一定的促進作用，但除葉面積、地上部干物質含量外，其他指標皆無統(tǒng)計學差異。此外，在AMF處理中，RI處理對植物生長性能的影響大于混合接種處理(MX)，AL處理的影響則小于MX處理，表明對植物的影響在混合處理后可能與其他AMF物種發(fā)生相互干擾。

表2 AMF對六堡茶菌根侵染率及生長參數(shù)的影響

2.2 叢枝菌根真菌對六堡茶茶葉化學養(yǎng)分元素含量的影響

由表3可以看出，與CK處理相比，RI處理的葉片N、P、K含量分別顯著提高了96.97%、74.51%、111.84%，AL處理的葉片N、P、K含量分別提高了25.39%、13.73%、30.19%，F(xiàn)M處理的葉片N、P、K含量分別提高了74.12%、123.53%、132.37%，混合處理(MX)的葉片N、P、K含量則分別增加了71.00%、15.69、98.55%。從中微量元素含量上看，與CK處理相比，RI處理的葉片Ca、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn含量分別顯著提高了317.26%、109.59%、96.20%、20.00%、68.37%、72.94%，AL處理的葉片Ca、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn含量分別增加了150.60%、47.95%、11.39%、6.67%、13.95%、14.69%，F(xiàn)M處理的葉片Ca、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn含量分別提高了160.12%、80.82%、37.97%、-13.33%、46.60%、114.69%，混合接種處理的葉片Ca、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn含量分別增加了234.52%、90.41%、51.90%、-26.67%、77.21%、50.99%。

表3 AMF對六堡茶茶葉養(yǎng)分元素含量的影響

2.3 叢枝菌根真菌對六堡茶茶葉化學組分的影響

由表4可以看出，與CK處理相比，接種AMF均在一定程度上提高了六堡茶茶葉多糖、總可溶性蛋白、兒茶素、總黃酮類化合物、茶多酚、咖啡堿和總游離氨基酸含量。與CK處理相比，接種AMF處理的茶葉多糖、總可溶性蛋白、兒茶素、總黃酮類化合物、茶多酚、咖啡堿和總游離氨基酸含量分別提高了82.66%～352.68%、76.81%～201.00%、42.36%～528.49%、130.59%～262.56%、64.07%～160.59%、1.19%～33.99%和0.41%～52.18%。整體來看，在接種AMF的處理中，RI處理的茶葉多糖、總可溶性蛋白、兒茶素、總黃酮類化合物、茶多酚、咖啡堿和總游離氨基酸含量整體較高，其次為混合處理(MX)、FM處理，AL處理的任一指標中皆顯著小于上述3個處理。與CK處理相比，AL處理與CK處理間皆存在顯著差異(除總游離氨基酸、咖啡堿含量)。

表4 AMF對六堡茶茶葉化學組分的影響

2.4 叢枝菌根真菌對六堡茶葉片品質相關酶基因相對表達量的影響

2.4.1 叢枝菌根真菌對六堡茶葉片氨基酸相關酶基因相對表達水平的影響 氨基酸是茶葉的主要化學成分，可以調節(jié)與平衡茶水中兒茶素、咖啡堿的苦味、黏度。谷氨酸脫氫酶(GDH)是調控氨基酸轉化的關鍵酶之一，谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)主要參與谷氨酸的GS/GOGAT循環(huán)。從上述3個調節(jié)酶的編碼基因(、、)表達水平看，、、的相對表達量未發(fā)生明顯上調或下調。從各處理的、、表達水平看，RI、FM、AL、MX、CK處理的基因相對表達量的規(guī)律不盡一致，且對于任一基因而言，上述處理間皆無顯著差異(圖1)。

2.4.2 叢枝菌根真菌對六堡茶葉片多酚相關酶基因相對表達水平的影響 茶多酚主要由兒茶素、 黃酮、花青素和酚類氨基酸等組成，是茶葉的主要提取物，其決定了茶葉的顏色、香氣、味道和功效。由圖2可以看出，接種AMF處理(AL、MX、FM、RI)在整體上調了的表達水平，不同處理的相對表達量呈CK

2.4.3 叢枝菌根真菌對六堡茶葉片咖啡堿相關酶基因相對表達水平的影響 咖啡堿是茶中主要的生化活性物質，可可堿合成酶(TCS)是茶樹咖啡堿生物合成途徑的關鍵酶，其中可同時調節(jié)合成可溴堿、咖啡堿。由圖3可知，接種AMF處理(AL、MX、FM、RI)在整體上上調了的表達水平，不同處理的相對表達量表現(xiàn)為CK

2.4.4 叢枝菌根真菌對六堡茶葉片黃酮類相關酶基因相對表達水平的影響 類黃酮是茶葉主要的功能性物質，苯丙氨酸解氨酶(PAL)和肉桂酸4-羥化酶(C4H)是類黃酮合成的主要關鍵酶。由圖4可知，在基因中，各處理表達量在1.29～4.85，以CK處理表達量最低，其與FM處理無顯著差異，均顯著低于RI、AL、MX處理；以RI處理表達水平最高，較其他處理顯著提高40.17%～275.97%。在基因中，不同處理表達水平呈CK

2.4.5 叢枝菌根真菌對六堡茶葉片兒茶素相關酶基因相對表達水平的影響 在茶葉多酚組分中，兒茶素約占茶多酚總量的70%～80%，在茶葉顏色、香氣和味覺品質的形成中起著重要作用。影響兒茶素含量的酶較多，如F3H、F3′H、F3′5′H、LAR、DFR、ANR和CHI等直接參與了兒茶素的合成。由圖5可以看出，與CK處理相比，接種AMF處理的相對表達量顯著提高了16.77%～42.13%，其中RI、MX處理的相對表達量較高，兩者分別顯著大于其他處理26.32%～72.8%、21.05%～65.6%。在基因的相對表達量上，CK、RI、FM、AL、MX處理在兩兩間皆存在顯著差異，其中以RI處理的相對表達量最高，顯著高于其他處理14.29%～66.34%，以CK處理的表達量最低，顯著低于其他處理10.62%～39.88%。

3 結論與討論

叢枝菌根真菌在土壤中廣泛存在，是重要的功能性微生物組成部分，大多數(shù)陸地植物可與其建立互惠共生關系，AMF可以協(xié)助植物吸收土壤中的礦質養(yǎng)分、協(xié)調生理生化代謝以及更好地應對環(huán)境生物/非生物脅迫等。在本研究中，接種AMF處理的根系侵染率為22.74%～51.33%，且不同AMF種類的侵染率存在明顯差異。本研究結果與前人研究結果一致，即不同植物宿主類型對于AMF具有特異招募性，不同AMF對宿主根系的依賴程度也存在一定差異，具體取決于AMF的特異性以及AMF與寄主植物之間的相容性。此外，本研究結果表明，混合接種處理的侵染率顯著低于單一接種處理(RI)，表明不同菌株在獲取宿主營養(yǎng)方面可能存在競爭關系。

在本研究中，與CK處理相比，接種AMF處理的總葉面積、株高、地上部及根系生物量皆整體較高。Fajardo等研究發(fā)現(xiàn)，接種異配盾孢囊霉()可顯著提高胡桃幼苗植株的地上部生物量和總葉面積。本研究結果與前人結果基本一致。AMF植物生物量和總葉面積的增加可能與外生菌絲改善根系養(yǎng)分獲取有關。本研究結果還表明，在接種AMF的處理中，不同處理間的生長參數(shù)整體呈AL

茶葉的化學組分與茶葉風味、香氣特征的生化物質組分及含量有關。在本研究中，接種AMF顯著提高了茶多酚、兒茶酸、黃酮類化合物、氨基酸和可溶性蛋白質的含量。Tchameni等研究發(fā)現(xiàn)，在可可上接種珠狀巨孢囊霉()、后，宿主葉片的氨基酸含量顯著增加。對生菜接種根內(nèi)根孢囊霉()和的混合物后，增加了生菜葉片可溶性蛋白質、可溶性糖含量。茶多酚、兒茶酸和黃酮類化合物具有很強的抗氧化活性，可對許多疾病起到預防作用。茶多酚是茶葉中主要的次生代謝產(chǎn)物，其中兒茶素含量可高達茶多酚總量的80%。黃酮類化合物被認為是誘導AMF發(fā)育的重要信號化合物，反過來，多酚也可被菌根共生所誘導。Zubek等研究發(fā)現(xiàn)，接種異型根孢囊霉()、及其混合處理皆可顯著增加三色堇根系的黃酮含量。但是目前關于AMF與黃酮合成的具體機制尚未揭示，在未來的工作中需要借助高通量及組學技術加以深入研究。

是限制活性氧產(chǎn)生的主要酶，其可促進次生代謝從而促進多酚合成。可影響咖啡堿的合成，、是影響黃酮化合物分泌的主要酶基因，、則與兒茶素合成密切相關。在本研究中，不同處理的、、、、、與其對應的化學組分呈相同趨勢，表明AMF可通過上調相關基因表達，從而促進次生代謝物合成、影響茶葉品質。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，上述基因表達水平與其對應的品質參數(shù)含量間并沒有呈現(xiàn)完全一致的趨勢，其原因可能是基因在經(jīng)轉錄、翻譯等過程中發(fā)生了變化，使得相關化學組分含量與其基因表達水平存在一定偏差。、和是影響氨基酸合成的主要酶基因，本研究發(fā)現(xiàn)總游離氨基酸含量呈CK