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    貴州草海鯽魚HIF-1α和HIF-2α基因克隆與表達(dá)分析

    2022-09-23 12:11:24葛傳龍歐陽力劍金志梅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年17期
    關(guān)鍵詞:精巢進(jìn)化樹鯽魚

    李 青, 葛傳龍, 歐陽力劍, 金志梅, 楊 欽

    (1.貴州省典型高原濕地生態(tài)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州畢節(jié) 551700; 2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院,貴州畢節(jié) 551700)

    云貴高原位于我國西南部,是我國四大高原之一,海拔在400~3 500 m間。貴州草海國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于云貴高原中部頂端,是一個(gè)典型的高原濕地生態(tài)系統(tǒng)。鯽魚不僅是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類,而且由于其多生活于水域的中下層,具有極強(qiáng)的低氧耐受性,是公認(rèn)的低氧耐受力極強(qiáng)的魚類之一。作為草海的優(yōu)勢(shì)魚種,鯽魚在長期高原低氧環(huán)境中,進(jìn)化出特有的身體機(jī)能以維持機(jī)體O平衡,彌補(bǔ)機(jī)體的缺氧反應(yīng)。

    低氧誘導(dǎo)因子HIF是由和亞基組成的一種異質(zhì)二聚體的轉(zhuǎn)錄因子,參與了動(dòng)物缺氧應(yīng)激的適應(yīng)和生存過程,在維持機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。和亞基均包含基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)基序和PAS結(jié)構(gòu)域。在常氧條件下,脯氨酰羥化酶PHD通過氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域ODD中2個(gè)保守的脯氨酸殘基的羥基化作用,使靶蛋白HIF亞基羥基化,隨之羥基化的HIF亞基被VHL蛋白識(shí)別并泛素化,介導(dǎo)蛋白降解。HIF激活細(xì)胞中一系列缺氧誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄,以應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境。在脊椎動(dòng)物中HIF至少有3個(gè)亞型,分別為HIF1、HIF2和HIF3。魚類中的研究已經(jīng)證明,HIF1主要在無氧呼吸中間體的氧氣攝取和運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用,而HIF2在血管和紅細(xì)胞的生成發(fā)揮重要作用。目前,關(guān)于HIF亞型的研究已在多種魚類中開展,而在耐低氧的鯽魚中的研究還鮮見報(bào)道?;诖耍狙芯炕谇捌趯?duì)草海鯽魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,利用生物信息學(xué)技術(shù)和PCR,克隆獲得了鯽魚中HIF 2個(gè)亞型和的全長 cDNA序列,并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能分析。此外,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了鯽魚中和mRNA在不同組織中的表達(dá)情況,以期為進(jìn)一步深入探究鯽魚耐低氧分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    于2018年在貴州威寧縣草海采集鯽魚[體長(14.98±4.25) cm;體質(zhì)量(68.71±5.25) g],取其腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血組織樣品,放入RNA Later(Tiangen)中,采樣點(diǎn):26°51′24.15″N,104°12′31.57″E,海拔:2 168.09 m。另采集3尾鯽魚帶回實(shí)驗(yàn)室,取其肝臟組織,液氮冷凍后置于-80 ℃低溫冰箱保存,用于后續(xù)RNA提取。

    1.2 鯽魚Ca-HIF1α和Ca-HIF2α全長的克隆與生物信息學(xué)分析

    提取鯽魚肝臟組織總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Stramd cDMA Synthesis Kit)。從鯽魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選和基因片段,使用DNAstar SeqMan軟件對(duì)篩選的目的片段進(jìn)行拼接。根據(jù)拼接獲得的和基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,由表1可知,對(duì)拼接獲得序列的正確性進(jìn)行驗(yàn)證,克隆獲得和基因的全長cDNA序列。利用DNAMAN軟件分析和基因全長cDNA序列中開放閱讀框及其編碼的氨基酸序列,SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析和基因編碼氨基酸序列的功能域,ExPASy(http://web.expasy.org/protparam)分析和基因編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)(pI)。

    表1 Ca-HIF1α和Ca-HIF2α基因序列擴(kuò)增和qRT-PCR引物序列

    1.3 HIF1α和HIF2α序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

    利用Clustal X軟件比對(duì)鯽魚與其他物種的和基因亞型翻譯的氨基酸序列的同源性,并用MEGA 4.0軟件進(jìn)行同源與聚類分析,采用鄰接法NJ構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,500次自舉(Bootstrap)重復(fù)檢驗(yàn)進(jìn)化樹的置信度。表2為各物種序列登錄號(hào),來自GenBank。

    表2 序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹物種信息

    1.4 鯽魚Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA表達(dá)模式分析

    分別提取腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血組織的RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa SYBR Premix Ex),根據(jù)和基因全長cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,鯽魚-基因作為內(nèi)參,由表1可知引物序列,每個(gè)樣本設(shè)計(jì)3個(gè)平行重復(fù),使用BioRad CFX96TM Real-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)和mRNA在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    使用Bio-Rad CFX Manager軟件分析熔解曲線,通過2-ΔΔ分析和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-way ANOVA對(duì)和mRNA在鯽魚不同組織相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,<0.05為差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 鯽魚HIF-1α和HIF-2α cDNA序列分析

    克隆獲得鯽魚中和cDNA全長序列(GenBank NO.:MW916102,MW916103),將其分別命名為和。由圖1可知,全長共有3 867 bp,其中,5′UTR為295 bp,3′UTR為1 247 bp,開放閱讀框2 322 bp,編碼774個(gè)氨基酸。由圖2可知,cDNA全長共4 647 bp,其中5′UTR為175 bp,3′UTR為 2 023 bp,開放閱讀框2 460 bp,編碼820個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)和基因編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分別為85.844、91.228 ku,等電點(diǎn)為5.12和6.20。SMART在線分析見圖3。由圖3可知,二者具有HLH、PAS和PAC結(jié)構(gòu)域,此外,多序列比對(duì)結(jié)果顯示二者還具有ODD、N-TAD 和C-TAD功能域。

    2.2 HIF1α和HIF2α亞型的同源性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

    多序列比對(duì)結(jié)果見圖4。由圖4可知,鯽魚 Ca-HIF1α 第27個(gè)氨基酸是絲氨酸(S),而Ca-HIF2α相對(duì)應(yīng)的第25個(gè)氨基酸是半胱氨酸(C)。Ca-HIF1α和Ca-HIF2α氨基酸序列不僅具有ODD、N-TAD和C-TAD 3個(gè)結(jié)構(gòu)域,且ODD結(jié)構(gòu)域具有2個(gè)保守的脯氨酸(P)位點(diǎn),其中,1個(gè)是LxxLAP位點(diǎn),該位點(diǎn)的序列并沒有發(fā)生突變。此外,C-TAD結(jié)構(gòu)域均具有保守的天冬酰胺(N)位點(diǎn),表明Ca-HIF1α 和Ca-HIF2α結(jié)構(gòu)域的保守性。進(jìn)化樹顯示,Ca-HIF1α和Ca-HIF2α分別與其他物種中相應(yīng)的亞型聚為一支。但Ca-HIF1α是先與花斑裸鯉、納木錯(cuò)裸鯉、扁咽齒魚、黃河裸裂尻魚、齊口裂腹魚、鯉魚的HIF1α聚為一支后,再與南亞野鯪的HIF1α聚為一支,最后與白鰱、草鯉魚和團(tuán)頭魴的HIF1α聚在一起。與之不同,白鰱、草鯉魚和團(tuán)頭魴HIF2α先聚為一支,南亞野鯪、齊口裂腹魚、花斑裸鯉、納木錯(cuò)裸鯉、黃河裸裂尻魚和扁咽齒魚聚為一支,然后2支匯聚,最后再與Ca-HIF2α聚在一起,提示Ca-HIF2α比Ca-HIF1α進(jìn)化得要快。

    2.3 Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA在鯽魚不同組織中的表達(dá)

    由圖5可知,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果顯示,和mRNA在所有被檢測(cè)的組織中均有表達(dá),其中,mRNA在所有組織中的相對(duì)表達(dá)量均高于mRNA的表達(dá)量。此外,mRNA在肝臟、鰓和精巢組織中的相對(duì)表達(dá)量最高,全血、心臟、腎臟、肌肉、脾臟和卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)量次之,在腸組織中的相對(duì)表達(dá)量最低。與之相似,mRNA在肝臟、鰓和全血組織中的相對(duì)表達(dá)量最高,卵巢、精巢、脾臟、心臟、腎臟和肌肉組織中的相對(duì)表達(dá)量次之,在腸組織中的相對(duì)表達(dá)量最低。

    3 討論

    3.1 鯽魚中Ca-HIF1α和Ca-HIF2α基因序列與系統(tǒng)進(jìn)化分析

    本研究克隆獲得鯽魚中基因2個(gè)亞型的全長cDNA序列,對(duì)序列比對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹顯示二者分別與其他物種中的HIF1α和HIF2α聚為一支。因此,將其分別命名為和。與其他物種中的同源蛋白一樣,Ca-HIF1α和Ca-HIF2α均具有HLH、PAS-A、PAS-B、PAC、N-TAD和C-TAD 6個(gè)結(jié)構(gòu)功能域,表明組成HIF1α和HIF2α的主要結(jié)構(gòu)域是高度保守的。與巨鯛()和HIF1α相關(guān)研究結(jié)果一致,Ca-HIF1α第27個(gè)氨基酸是絲氨酸(S),Ca-HIF2α對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的第25個(gè)氨基酸是半胱氨酸(C),HIFα中HLH結(jié)構(gòu)域中還原性半胱氨酸的存在主要與介導(dǎo)動(dòng)物的氧敏感性有關(guān),此不同之處導(dǎo)致Ca-HIF2α在DNA結(jié)合過程中可能比Ca-HIF1α對(duì)氧化還原更敏感。Ca-HIF1α與Ca-HIF2α結(jié)構(gòu)上的這些區(qū)別可能導(dǎo)致二者具有各自獨(dú)特的功能,且Ca-HIF2α在系統(tǒng)進(jìn)化中比Ca-HIF1α要快。然而,Ca-HIF1α和Ca-HIF2α在ODD結(jié)構(gòu)域均具有2個(gè)保守的脯氨酸(P),且與人類中的HIFα同源蛋白相似,保有了LxxLAP位點(diǎn),LxxLAP位點(diǎn)的突變是動(dòng)物適應(yīng)高原低氧環(huán)境的重要標(biāo)志,這可能與鯽魚是耐低氧動(dòng)物有關(guān)。此外,Ca-HIF1α和Ca-HIF2α在C-TAD結(jié)構(gòu)域均具有天冬酰胺,2個(gè)保守的脯氨酸主要參與了蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),天冬酰胺主要參與誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄,這些殘基的保守性,表明其在促進(jìn)魚類和哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄活性方面具有功能保守性。

    3.2 鯽魚不同組織中Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA水平表達(dá)差異分析

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,在常氧條件下,和mRNA在所檢測(cè)組織(腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血)中均有表達(dá),與巨鯛()、斑馬魚、齊口裂腹魚()和軟刺裸鯉()中研究結(jié)果相一致,和mRNA在鰓組織中的表達(dá)量均最高。此外,與巨鯛()相似,mRNA在鯽魚肝臟和精巢組織中的表達(dá)量均很高。而mRNA在卵巢組織中表達(dá)量較高,mRNA在卵巢組織中的表達(dá)量較低。與同時(shí)耐低氧的草魚中結(jié)果不同,和mRNA在鯽魚的腎臟組織中表達(dá)量均不高。和mRNA在鯽魚腸組織中的低表達(dá),可能是由于腸道組織水平的日常變化,二者參與了腸道穩(wěn)態(tài)的維持。以上結(jié)果說明-在維持機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮至關(guān)重要作用,但和這2個(gè)亞型mRNA水平的表達(dá)差異性表明二者在調(diào)控氧穩(wěn)態(tài)方面具有分工。此外,二者在精巢、卵巢和全血組織中的表達(dá),推測(cè)其可能參與介導(dǎo)了血細(xì)胞和生殖細(xì)胞的發(fā)育。

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