峨眉金線(xiàn)蓮ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

謝孔平, 楊適, 毛冀, 魯松

1.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川 成都 610015；

2.野生植物四川省科技資源共享服務(wù)平臺(tái)，四川 成都 610015；

3.峨眉山生物多樣性四川省野外科學(xué)觀(guān)測(cè)研究站，四川 峨眉山 610041

金線(xiàn)蓮為蘭科開(kāi)唇蘭屬（Anoectochilus）多年生珍稀中草藥。據(jù)中國(guó)植物志記載我國(guó)有20種，2變種，產(chǎn)于我國(guó)西南部至南部[1]。另外根據(jù)多數(shù)學(xué)者的研究，認(rèn)為開(kāi)唇蘭屬和齒唇蘭屬（Odontochilus）在形態(tài)上區(qū)別比較小，主張將齒唇蘭屬合并入開(kāi)唇蘭屬[1]。近些年金線(xiàn)蓮作為藥用植物盛于閩臺(tái)，在當(dāng)?shù)赜小八幹兄酢钡拿婪Q(chēng)，又被人稱(chēng)為“鳥(niǎo)人參”，民間治療范圍極廣[2]。據(jù)《福建藥物志》記載其性味平、甘，清熱涼血、祛風(fēng)利濕，主治咯血、支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病，乳糜尿，血尿，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，小兒急驚風(fēng)，毒蛇咬傷等[3-5]。而據(jù)《中國(guó)本草原色圖譜》記載臺(tái)灣金線(xiàn)蓮性味性平微寒, 味甘微苦無(wú)毒，入肝肺胃心脾諸經(jīng)，功能具解熱、清火退火降血壓功能, 主療肝脾病，肺腫病, 遺精遺漏諸病, 兼治胸痛胰痛咳嗽血虛血熱吐血, 肝火小兒發(fā)育不良及毒蛇咬傷等[3,6]。目前金線(xiàn)蓮的藥用及商用價(jià)值逐漸被人們認(rèn)可，逐漸由閩臺(tái)地區(qū)向全國(guó)其他省份發(fā)展，許多地區(qū)都有開(kāi)發(fā)種植?，F(xiàn)在市場(chǎng)最多的商品開(kāi)發(fā)種主要為常被稱(chēng)作福建金線(xiàn)蓮的花葉開(kāi)唇蘭（A. roxburghii）和常被市場(chǎng)稱(chēng)為銀線(xiàn)蓮的臺(tái)灣開(kāi)唇蘭（A. formosanus）[2]。前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)在廣西、浙江、云南、四川、貴州等地都有野生種群也有被開(kāi)發(fā)銷(xiāo)售，常見(jiàn)的種有峨眉金線(xiàn)蘭（Anoectochilus emeiensis）、浙江金線(xiàn)蘭（A. zhejiangensis）、滇越金線(xiàn)蘭（A. chapaensis）、滇南開(kāi)唇蘭（A. burmannicus）等。生產(chǎn)銷(xiāo)售中常把上述不同種不同產(chǎn)地的金線(xiàn)蓮統(tǒng)稱(chēng)為金線(xiàn)蓮[2]。

峨眉金線(xiàn)蓮的研究較少，目前有報(bào)道的有峨眉金線(xiàn)蓮的組織培養(yǎng)等方面的工作[2,7]。金線(xiàn)蓮遺傳多樣性的研究在福建金線(xiàn)蓮中已有研究，但峨眉金線(xiàn)蓮此方面的工作仍屬空白，因此亟需開(kāi)展此方面的研究。近些年各種分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展為開(kāi)展峨眉金線(xiàn)蓮的遺傳多樣性研究提供了很好的支持，其中ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在福建金線(xiàn)蓮和臺(tái)灣金線(xiàn)蓮不同種群，不同產(chǎn)地，不同品系的鑒定等方面都表現(xiàn)出了較好的結(jié)果，但在峨眉金線(xiàn)蓮中還未得到驗(yàn)證。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)基于PCR擴(kuò)增，使用微衛(wèi)星引物產(chǎn)生多態(tài)位點(diǎn)標(biāo)記的技術(shù)，相比較于其他分子標(biāo)記手段具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)且不需要預(yù)知基因組序列[8-11]。近些年在多種植物中ISSR的實(shí)驗(yàn)技術(shù)在遺傳多樣性的分析中發(fā)揮了比較重要的作用[12-15]。研究擬對(duì)影響峨眉金線(xiàn)蓮ISSRPCR反應(yīng)體系的5個(gè)因素（TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+，引物和DNA模板含量）利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化分析，另外對(duì)優(yōu)化后的體系通過(guò)梯度PCR的方法篩選退火溫度（Tm），以解決由于ISSR實(shí)驗(yàn)中引物序列單一多種因素會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問(wèn)題，從而可以建立峨眉金線(xiàn)蓮種群遺傳多樣性ISSRPCR的最佳反應(yīng)體系。

1 實(shí)驗(yàn)材料

所用試驗(yàn)所用的峨眉金線(xiàn)蓮（A. roxburghii）材料皆是2015年野外采集的野生資源，移植在峨眉山生物資源實(shí)驗(yàn)站種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)。同時(shí)采集不同種群的蒴果以常規(guī)組培方法進(jìn)行組織培養(yǎng)，所用配方參考魯松等[7]。待成苗長(zhǎng)至8 cm左右采集其成熟葉片用作體系優(yōu)化、退火溫度篩選等。引物由哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR反應(yīng)體系引物序列中選擇，所選擇的引物序列為ISSR834，由成都擎科生物科技有限公司合成，序列為∶5'-AGAGAGAGAGAGAGAGYT-3'。DNA提取所用的常規(guī)生物耗材購(gòu)自成都科龍化工有限公司，PCR體系構(gòu)建所需的酶、DL2000 DNA Marker及電泳驗(yàn)證所用的瓊脂糖等均購(gòu)自TaKaRa公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA提取

峨眉金線(xiàn)蓮葉片DNA 的提取采用改良CTAB 法及采用天根生化科技有限公司的植物總DNA提取試劑盒提取，用核酸蛋白含量測(cè)定儀和10 g·L-1瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA濃度和純度，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察提取結(jié)果，然后將符合試驗(yàn)要求的模板DNA濃度稀釋為10 ng/μL，儲(chǔ)存于-20°C冰箱中冷藏備用。所用檢測(cè)凝膠成像系統(tǒng)及后續(xù)PCR擴(kuò)增結(jié)果分析所用凝膠成像系統(tǒng)均為Gel Doc EZ Imager（Bio-Rad）。

2.2 PCR擴(kuò)增與體系正交實(shí)驗(yàn)

正交試驗(yàn)采用5因素4水平的設(shè)計(jì)進(jìn)行篩選L16（45），對(duì)引物ISSR834、Taq 酶濃度、模板DNA含量、dNTPs、Mg2+進(jìn)行篩選，具體含量見(jiàn)表1和表2。采用總體積為25 μL的反應(yīng)體系，包含了2 μL的10× PCR Buffer， ddH2O 補(bǔ)足最終體積。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了Bio-Rad公司的C1000 Touch Thermal Cycler型號(hào)PCR儀。其反應(yīng)程序設(shè)置為：94°C，變性5 min；94°C，變性45 s；53°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45個(gè)循環(huán)；72°C，變性10 min。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。之后對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，其中電泳條帶數(shù)量最多、清晰度高和背景低的最佳組合記16分，最差組合記1分，統(tǒng)計(jì)各個(gè)組合的評(píng)分?jǐn)?shù)，然后對(duì)評(píng)分進(jìn)行極差分析[10-11]。

2.3 退火溫度（Tm）的確定

采用德國(guó)Eppendorf Mastercycler X50梯度PCR儀梯度進(jìn)行最佳退火溫度（Tm）的確定，設(shè)定退火溫度為50°C~60°C，采用上述正交試驗(yàn)中篩選出的最優(yōu)反應(yīng)體系，對(duì)Tm進(jìn)行梯度測(cè)驗(yàn)。由PCR儀自動(dòng)生成7個(gè)溫度梯度[10,11]。

2.4 對(duì)優(yōu)化的ISSR-PCR擴(kuò)增體系的驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，獲得最佳反應(yīng)體系和最適退火溫度（Tm），用引物ISSR834對(duì)12份不同種群的野生峨眉金線(xiàn)蓮材料進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，從而驗(yàn)證最終的ISSR優(yōu)化擴(kuò)增體系。

表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)因素及水平Tab.1 Level of ISSR-PCR system factors in orthogonal design

表2 ISSR-PCR反應(yīng)體系L16（45）正交設(shè)計(jì)及直觀(guān)分析表Tab.2 L16（45） orthagonal design for ISSR-PCR and intuitive analysis

3 結(jié)果與分析

3.1 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

圖1-a為本實(shí)驗(yàn)16個(gè)ISSR-PCR正交試驗(yàn)的結(jié)果，由圖可見(jiàn)，不同的處理間DNA模板含量、Taq酶的濃度、dNTPs及Mg2+的濃度不同而導(dǎo)致PCR試驗(yàn)的擴(kuò)增結(jié)果有比較明顯的差異，主要表現(xiàn)在擴(kuò)增條帶的多態(tài)性、特異性、亮度及清晰度等方面。在16個(gè)反應(yīng)體系中，多態(tài)性低而且主帶不是很明顯的有組合1、2、3、10和14；部分條帶背景界限模糊、有些條帶比較微弱的組合有5、11、12、13及16；條帶強(qiáng)度比較高、多態(tài)性好、且條帶界限比較分明的是組合4與7；其中按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分最高的是組合4，由圖可見(jiàn)其條帶明亮的最多、界限比較明顯，多態(tài)性最好。綜合各種因素，最終得到的峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR正交試驗(yàn)總體積25 μL的最佳反應(yīng)體系中各成分的組成為：2.0 μL 10× Buffer、40 ng DNA模板、0.4 μmol·L-1引物、0.4 mmol·L-1dNTPs、2.0 mmol·L-1Mg2+及0.8 U Taq DNA 聚合酶。

3.2 極差分析

表2為峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)以834為引物的各因素的極差分析結(jié)果，表明各因素對(duì)PCR擴(kuò)增體系的影響程度和極差的大小成正比。不同因素的影響程度從引物的濃度、TaqDNA聚合酶含量、Mg2+含量、DNA模板的濃度、dNTPs依次從大到小排列。擴(kuò)增結(jié)果最為理想，評(píng)分最高的為組合4。

3.3 退火溫度（Tm）的優(yōu)化結(jié)果

圖1-b為以上述組合4的體系即最佳PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)結(jié)果，以834為引物，進(jìn)行最佳退火溫度（Tm）的篩選。表明在50°C~60°C的溫度梯度范圍內(nèi)，PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨著退火溫度的不同而有不同的表現(xiàn)。且隨著退火溫度的逐漸升高，部分?jǐn)U增條帶逐漸清晰，而且界限比較明顯，數(shù)量也逐漸增多，在退火溫度為56.5°C時(shí)擴(kuò)增的結(jié)果表現(xiàn)最好，而超過(guò)56.5°C后部分條帶逐漸轉(zhuǎn)弱，數(shù)量變少，在最高溫度60°C時(shí)無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，而在退火溫度較低的情況下，部分條帶較暗，數(shù)量較少。因此，峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的最佳退火溫度為56.5°C。綜上，將擴(kuò)增程序確定為：94°C，變性5 min；94°C，變性45 s；56.5°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45個(gè)循環(huán)；72°C，變性10 min。

圖1 1-a：峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR正交試驗(yàn)電泳圖；1-b：引物834退火溫度篩選；1-c:引物834對(duì)12份峨眉金線(xiàn)蓮的ISSR-PCR擴(kuò)增Fig.1 Fig.1-a: Electrophoresis diagram of ISSR-PCR orthogonal test of Anoectochilus omeiensis; 1-b：Selection of annealing temperature of primer 834; 1-c: ISSR-PCR amplification of 12 Anoectochilus omeiensis samples with primer 834.

3.4 最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

由圖1-c所示，采用引物ISSR834對(duì)其他12份不同種群的峨眉金線(xiàn)蓮種質(zhì)材料進(jìn)行了擴(kuò)增，以驗(yàn)證和檢測(cè)上述優(yōu)化的峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR反應(yīng)體系和最佳退火溫度。結(jié)果表明，12個(gè)不同種群的野生峨眉金線(xiàn)蓮葉片DNA為模板的實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增條帶均能夠表現(xiàn)出非特異性擴(kuò)增條帶比較少、清晰明顯、界限分明、多態(tài)性高的特點(diǎn)。這證明了本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的體系有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和較高的可靠性，該體系可以用于后續(xù)的峨眉金線(xiàn)蓮及開(kāi)唇蘭屬植物的野外種群的遺傳多樣性分析研究。同時(shí)將該體系應(yīng)用于其他引物，如807，811，822，827，841等，除重新優(yōu)化退火溫度外，該體系的擴(kuò)增都獲得了良好的效果。

3.5 834引物對(duì)不同種群的鑒定結(jié)果

引物834（見(jiàn)圖1-c）對(duì)峨眉金線(xiàn)蓮12個(gè)野生種群的分析結(jié)果顯示共具有4條多態(tài)性條帶，分別位于1 600 bp、1 450 bp、860 bp及630 bp。其中1 450 bp條帶為種群2所特有，而1 600 bp為種群1和2所特有，860 bp條帶為種群8所特有，630 bp條帶可以較好地把12個(gè)種群分為兩大組1，2，6，8等為一組，剩余地8個(gè)種群為一組。且上述4個(gè)條帶強(qiáng)度都較強(qiáng)。另外630 bp條帶兩大組中1，2，6，8組樣品皆表現(xiàn)為圓葉型，其余8組皆表現(xiàn)為橢圓且?guī)Ъ奔庑腿~，就上述12個(gè)種群的分析看630 bp為圓葉種群的特有條帶。綜合分析來(lái)看834引物在峨眉金線(xiàn)蓮野生種群的擴(kuò)增條帶多態(tài)性較高，可以用于后續(xù)不同種群不同表型的峨眉金線(xiàn)蓮種群的遺傳多樣性分析。

4 討論

ISSR-PCR的實(shí)驗(yàn)方法，通常以1-4個(gè)堿基串聯(lián)組成的16-18個(gè)重復(fù)微衛(wèi)星序列和幾個(gè)非重復(fù)的錨定堿基為引物，提高了PCR擴(kuò)增反應(yīng)的專(zhuān)一性，同時(shí)又具有成本低、穩(wěn)定性及重復(fù)性好等特點(diǎn)，能比較好地揭示實(shí)驗(yàn)物種地遺傳多樣性特點(diǎn)，故而被很多科研人員采用。但是作為一種基于PCR的分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往會(huì)受到多種因素的影響，而且在不同科屬的植物中也有比較大的差異，甚至同一屬不同種之間都會(huì)有很大的不同。在用ISSR-PCR的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)常常需要獲得適合不同植物擴(kuò)增的最優(yōu)反應(yīng)體系。單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法常被用來(lái)優(yōu)化ISSRPCR的反應(yīng)體系，近些年此類(lèi)的研究較多。其中常采用梯度試驗(yàn)的方法來(lái)進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以探索單個(gè)因素的最適條件，如張福生等之前對(duì)金線(xiàn)蓮的ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系優(yōu)化就采用了此種方法[9,11,16]。但此種方法需要擴(kuò)增多次，所需時(shí)間精力較大，會(huì)增加不少成本而且不能兼顧考察各個(gè)因素之間的交互影響。因此許多學(xué)者采用正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法來(lái)探索最優(yōu)體系，如唐軍榮等就采用了此種方法來(lái)探索金線(xiàn)蓮的最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系[17]，此種方法可以兼顧各個(gè)影響因子的交互作用，許多研究人員在多種植物中都采用了此種方法來(lái)探索ISSR的最優(yōu)體系，如：唐楠等在白芥（Sinapis alba），黃曉慧等在蘭屬（Cymbidium），陳云霞等在銀縷梅（Shaniodendron subaequale），劉玲在桑屬（Morus），田霞在葛縷子（Carum carvi）等植物中都采用了此法[18-22]。

根據(jù)極差分析結(jié)果，引物濃度是影響峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果最大的因素，這與陳云霞等在銀縷梅，朱成豪等在鱗尾木（Lepionurus sylvestris），錢(qián)前等在黑果枸杞（Lycium ruthenicum）中的結(jié)果一致[20,23,24]，引物的濃度高低對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量及PCR反應(yīng)的特異性都有影響。這個(gè)結(jié)果與唐軍榮等在金線(xiàn)蓮中的結(jié)果不一致，他們的結(jié)果顯示Taq酶的濃度是影響因素最大的。本實(shí)驗(yàn)中Taq酶對(duì)峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響僅次于引物濃度，Taq酶在PCR實(shí)驗(yàn)中往往關(guān)系著實(shí)驗(yàn)的成敗，是擴(kuò)增反應(yīng)的催化劑，其濃度的高低會(huì)影響擴(kuò)增效率及非特異性條帶的產(chǎn)生，如彭慧等在異鱗石山棕（Guihaia heterosquama），經(jīng)建永等在歐洲李（Prunus domestica），唐雨晨等在藜蘆（Veratrum nigrum），高慧新等在褐苞薯蕷（Dioscorea persimilis）中都發(fā)現(xiàn)Taq酶的濃度是影響因素最大的[14,25-27]。Mg2+濃度的影響在本實(shí)驗(yàn)中次于Taq酶，Mg2+濃度的大小會(huì)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生直接的影響，其濃度的高低一是可以影響酶的活性，另外還可以影響DNA模板與引物結(jié)合的效率，如郭傲等在無(wú)花果（Ficus carica），任雪羽等在木槿（Hibiscus syriacus），陳曦等在藍(lán)花丹（Plumbago auriculata），田霞等在藏茴香（Carum carvi）中都發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度的大小是影響ISSRPCR擴(kuò)增效果最大的因素[15,22,28,29]。DNA模板的含量及質(zhì)量也關(guān)系著PCR實(shí)驗(yàn)的成敗，但在本實(shí)驗(yàn)的極差分析結(jié)果顯示其影響相對(duì)較小，這與黃曉慧等在蘭屬，丁雯等在酸棗（Ziziphus jujubavar.spinosa），黃旭萍等在山烏桕（Triadica cochinchinensis），劉玲等在桑屬（Morus）中都發(fā)現(xiàn)DNA模板濃度的高低是影響ISSR-PCR擴(kuò)增效果最大的因素的結(jié)果不同[12,19,21,30]。相比較于其他因素，dNTPs的含量在峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR極差分析值最小，dNTPs是ISSR-PCR反應(yīng)的原材料之一，其濃度的高低可以影響PCR的錯(cuò)配及產(chǎn)物的合成效率，唐楠等在白芥，林丹等在云南沉香（Aquilaria yunnanensis），羅湘等在龍珠果（Passiflora foetida），張婉茹等在稗草（Echinochloa crusgalli）中都發(fā)現(xiàn)dNTPs濃度的高低是最大的影響因素[13,18,31,32]。

引物的退火溫度（Tm）是影響擴(kuò)增反應(yīng)的另一重要因素[33]，本實(shí)驗(yàn)最終確定了引物834在峨眉金線(xiàn)蓮的ISSR-PCR反應(yīng)中的最適退火溫度為56.5°C，適宜的引物退火溫度顯著增加擴(kuò)增條帶數(shù)，條帶的清晰度及特異性。這與張福生等的結(jié)果不同，可能與所采用的不同種材料有關(guān)。

綜上所述，利用5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)探討了各因素的不同水平對(duì)峨眉金線(xiàn)蓮ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響，建立了穩(wěn)定且重復(fù)性好的ISSR-PCR反應(yīng)體系，即在25 μL體系中含：40 ng DNA模板、0.4 μmol·L-1引物、0.4 mmol·L-1dNTPs、2.0 mmol·L-1Mg2+、0.8 U Taq DNA 聚合酶、2.0 μL 10× Buffer。同時(shí)篩選了最適的退火溫度（Tm），提出適合峨眉金線(xiàn)蓮的ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)程序?yàn)椋?4°C，變性5 min；94°C，變性45 s；56.5°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45個(gè)循環(huán)；72°C，變性10 min。該體系對(duì)以ISSR分子標(biāo)記為手段來(lái)分析峨眉金線(xiàn)蓮的野生種群的遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為同屬的其他植物有參考價(jià)值。