微小RNA-203預(yù)測(cè)胃癌肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后的臨床價(jià)值

姜孝奎，李振想，孟鑫，李韶山

胃癌（gastric cancer，GC）是一種高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，被列為癌癥相關(guān)死亡的第二大誘因，并在全球造成較大的健康負(fù)擔(dān)［1］。盡管在GC的治療上已經(jīng)取得了較大的進(jìn)步，但由于頻繁復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移使GC病人的預(yù)后仍令人沮喪，肝臟是晚期胃癌血行轉(zhuǎn)移的常見部位［2-3］。為了克服這些臨床問(wèn)題，顯然需要識(shí)別早期復(fù)發(fā)或預(yù)后不良的生物標(biāo)志物［4］。miR-203對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后的評(píng)估價(jià)值還未有研究，本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-203為外泌型miRNA，檢測(cè)病人外周血中miR-203的水平，分析不同病理特征間的表達(dá)差異及對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移和術(shù)后3年死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年1月至2017年12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的胃癌病人115例，男74例，女41例，年齡（56.7±11.3）歲，范圍為32～75歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后經(jīng)病理學(xué)診斷為胃癌；②原發(fā)性胃癌；③術(shù)前未經(jīng)過(guò)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有傳染性疾病、自身免疫病或其他腫瘤；②術(shù)后未完成放化療；③失訪病人。同時(shí)收集健康志愿者40例為非胃癌病人組，男23例，女17例，年齡（54.7±12.6）歲，范圍為34～70歲。

1.2 臨床資料收集及術(shù)后隨訪收集病人的一般臨床資料，主要包括：性別、年齡、原發(fā)腫瘤（T）分期、淋巴結(jié)（N）分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）分期、原發(fā)腫瘤、淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（TNM）分期、胃癌肝轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、腫瘤長(zhǎng)徑、術(shù)后3年存活情況。以門診和電話相結(jié)合的方式進(jìn)行術(shù)后隨訪，最短隨訪時(shí)間14個(gè)月，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間36個(gè)月。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)外周血中miR-203 的表達(dá)水平收集病人外周血5 mL，以3 000 r/min的速度離心15 min，留取上清放置-80℃冰箱中待用。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，使用miRNA分離試劑盒從血清和培養(yǎng)基樣品中提取miRNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0時(shí)視為合格品，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：40℃、40 min，30℃、10 min。以cDNA為模板。引物序列：miR-203正 向 引 物 序 列 為5′-CTTGCTACTTCATTCAACCAC-3′、反 向 引 物 序 列 為5′-AGTTTGACGTTAGTCCAA-3′，U6正向引物序列為5′-CTGCGTAATCCTCTGCCTAT-3′、反向引物序列為5′-GTCCCACCGTGTGGTAACCG-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水9.5 μL。反應(yīng)條件：95℃、20 s，95℃、10 s、60℃、20 s共40個(gè)循環(huán)，最后70℃、10 s。反應(yīng)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)每樣本循環(huán)閾值（CT）。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-203相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件，計(jì)量資料行正態(tài)性檢測(cè)，符合正態(tài)分布的資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)的方法，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，單因素和多因素logistic回歸分析和Cox回歸分析檢測(cè)影響胃癌肝轉(zhuǎn)移和胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡的危險(xiǎn)因素，ROC分析miR-203對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移和胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌病人外周血中miR-203 的表達(dá)水平與病人臨床病例特征的關(guān)系胃癌病人外周血中miR-203的表達(dá)水平為0.482±0.107，低于非胃癌病人外周血中的水平1.529±0.154（t=8.20，P＜0.001）。胃癌病人的N分期、M分期、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、術(shù)后3年存活情況與miR-203的表達(dá)水平有關(guān)（P＜0.05），見表1。

表1 胃癌115例外周血中miR-203的表達(dá)水平與臨床病例特征的關(guān)系/

表1 胃癌115例外周血中miR-203的表達(dá)水平與臨床病例特征的關(guān)系/

病例特征年齡＜60歲≥60歲性別男女T分期T1/T2 T3/T4 N分期N0 N1/N2/N3 M分期M0 M1 TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ肝轉(zhuǎn)移陰性陽(yáng)性腹膜轉(zhuǎn)移陰性陽(yáng)性腫瘤長(zhǎng)徑＜3 cm≥3 cm術(shù)后3年存活情況存活死亡例數(shù)60 55 74 41 37 78 67 48 84 31 58 57 90 25 103 12 81 34 93 22 miR-203水平0.504±0.185 0.402±0.143 0.471±0.114 0.435±0.107 0.481±0.154 0.425±0.130 0.691±0.251 0.215±0.117 0.652±0.273 0.254±0.105 0.745±0.214 0.235±0.084 0.705±0.087 0.201±0.207 0.734±0.063 0.172±0.102 0.487±0.124 0.419±0.082 0.594±0.110 0.312±0.104 t值1.95 1.02 0.95 5.30 5.02 6.34 6.32 6.82 1.35 4.32 P值0.098 0.132 0.541＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.105＜0.001

2.2 logistic回歸分析影響胃癌肝轉(zhuǎn)移的因素以胃癌是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移為自變量，將表1中的因素和miR-203水平代入logistic單因素回歸模型中，結(jié)果顯示T分期、N分期、M分期、TNM分期和miR-203對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移有影響，將對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移有影響的因素代入logistic多因素回歸模型中，結(jié)果顯示N分期、M分期、TNM分期和miR-203為影響胃癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表2。

表2 胃癌115例術(shù)后肝轉(zhuǎn)移單因素和多因素logistic回歸分析

2.3 Cox回歸分析影響胃癌術(shù)后3年死亡的因素以胃癌術(shù)后3年內(nèi)是否死亡為自變量，將表1中的因素和miR-203水平代入Cox單因素回歸模型中，結(jié)果顯示N分期、M分期、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移和miR-203對(duì)胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡有影響，將對(duì)胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡有影響的因素代入Cox多因素回歸模型中，結(jié)果顯示N分期、M分期、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移和miR-203為影響胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 胃癌115例術(shù)后3年死亡單因素和多因素Cox回歸分析

2.4 外周血中miR-203 預(yù)測(cè)胃癌肝轉(zhuǎn)移、胃癌術(shù)后預(yù)后不良的臨床價(jià)值外周血中miR-203預(yù)測(cè)胃癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的曲線下面積（95%CI）為0.91（0.86，0.92），特異度為81.4%，靈敏度為80.3%。預(yù)測(cè)胃癌術(shù)后3年內(nèi)病人死亡的曲線下面積（95%CI）為0.85（0.81，0.89），特異度為72.4%，靈敏度為89.3%。

3 討論

胃癌是一種致命的惡性腫瘤，臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)［5-6］。盡管人們對(duì)遺傳和表觀遺傳學(xué)的癌癥事件的了解越來(lái)越多，但缺乏早期評(píng)估GC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的非侵入性方法或生物標(biāo)記物。非編碼RNA特別是miRNA進(jìn)入“癌癥領(lǐng)域”已有10多年的歷史，miRNA是內(nèi)源性的小非編碼RNA分子，長(zhǎng)度為19-22個(gè)核苷酸［7］。超過(guò)50%的人類miRNA位于脆弱位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［8-9］。多項(xiàng)研究顯示，胃癌組織中多種miRNA表達(dá)失調(diào)，更重要的是有些可以在體循環(huán)中被檢測(cè)到。循環(huán)系統(tǒng)中miRNA水平的改變可能與GC病人的生理和病理改變直接相關(guān)［10-12］。

MiR-203是公認(rèn)的抑癌基因，也是啟動(dòng)子甲基化過(guò)度的靶標(biāo)，已被證實(shí)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和腫瘤血管生成［13-15］。盡管miR-203在GC中已有報(bào)道，對(duì)miR-203的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲有影響，但未有研究探討其作為血清生物標(biāo)志物的可行性［16］。本研究外周血中miR-203表達(dá)水平與N分期、M分期、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、術(shù)后3年存活情況有關(guān)，此結(jié)果與以往的研究結(jié)果有相似之處［17-18］。本研究顯示在肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人血清miR-203水平均較低，說(shuō)明miR-203水平降低有利于轉(zhuǎn)移。MiR-203發(fā)揮腫瘤抑制作用［19-20］，可能在GC細(xì)胞中被下調(diào)，因此GC細(xì)胞不能在細(xì)胞外環(huán)境中產(chǎn)生足量的miR-203，導(dǎo)致其在外周血中的水平降低。以上結(jié)果表明，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移和胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡的病人外周血中可檢測(cè)到低水平的miR-203，臨床對(duì)外周血中miR-203監(jiān)測(cè)，對(duì)預(yù)測(cè)GC轉(zhuǎn)移和術(shù)后的存活可能具有一定的臨床價(jià)值。同時(shí)回歸分析顯示，miR-203為胃癌肝轉(zhuǎn)移和胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-203對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移和胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，miR-203在胃癌外周血中的表達(dá)水平降低對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移和胃癌術(shù)后3年內(nèi)死亡具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。