生長抑素聯(lián)合人轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白D1通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路調(diào)控胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

王書芬，倪猛，薛萌

胰腺癌作為消化道常見的惡性腫瘤，在我國，胰腺癌病人的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別排第10位和第6位，而早期胰腺癌病人的確診率不高，大多數(shù)病人在確診時已經(jīng)是晚期，已經(jīng)錯過最佳的治療時期，導(dǎo)致5年的預(yù)后生存率僅為2%～9%［1-2］。生長抑素是一種多肽類激素，在腦、胃腸和胰腺組織中含量較高，通過抑制胰酶和胰液的分泌，保護胰腺細胞［3］。劉力等［4］研究結(jié)果顯示，生長抑素通過聯(lián)合吉西他濱抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。人轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白D1（FOXD1）在多種癌癥中異常表達，如FOXD1在胰腺癌組織和細胞中表達上調(diào)，敲減FOXD1可以明顯抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲［5］。PI3K/AKT通路與胰腺癌中發(fā)揮著重要的作用，在胰腺癌中常常被激活［6］，有研究結(jié)果顯示，胰腺癌缺失位點4（DPC4）基因通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）通路抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲和上皮間只轉(zhuǎn)化［7］。但是關(guān)于生長抑素能否通過聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT通路是在胰腺癌細胞中的研究尚不明確，因此，本研究于2018年12月至2019年12月通過探討生長抑素聯(lián)合FOXD1通過PI3K/AKT通路調(diào)控胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，為胰腺癌的研究提供合理的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑胰腺癌細胞PANC-1購買于美國ATCC研究中心；胎牛血清（10025632C）購買于賽默飛生物、DMEM培養(yǎng)基（PAC0036）購買于武漢博士德生物公司；注射用生長抑素購買于揚子江集團藥業(yè)公司，批號H20066708，批次20180530，規(guī)格 ：3 mg；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒（10523005）購買于美國Thermo Fisher公司；pcDNA、FOXD1和引物購買于上海吉瑪公司；PI3K抑制劑LY294002（HY-10123）購買于美國Med Chem Express公司；MTT試劑盒（P0102S）購買于碧云天生物公司；Transwell小室（258730236120）、Matrigel基質(zhì)膠（334002）購買于美國BD公司；增殖細胞核抗原（PCNA）抗體（ab12165）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體（ab204523）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-9）抗體（ab140352）、FOXD1抗體（ab128311）、磷酸化磷脂肌醇3激酶（p-PI3K）抗體（ab31075）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體（ab8201）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抗體（ab120245）、蛋白激酶B（AKT）抗體（ab32451）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（ab7221）購買于購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白G（IgG）（ym-a0137G-HRP）購買于上海恒斐生物公司；Trizol試劑盒（9078）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR024A）、SYBR Green Premix試劑盒（RB732A）購買于大連寶生物工程有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組胰腺癌細胞PANC-1采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于5%二氧化碳、37℃條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育培養(yǎng)，2～3 d后進行傳代培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的PANC-1細胞接種24孔細胞板內(nèi)（5×104個/孔），采用生長抑素濃度為0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L處理細胞，記為各生長抑素各劑量組，其中生長抑素濃度為0 mg/L和400 mg/L，記為Control組和SST組；參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將pcDNA和FOXD1轉(zhuǎn)染至PANC-1細胞，經(jīng)過400 mg/L的生長抑素及20 mol/L的PI3K抑制劑LY294002處 理 細 胞 ，記 為SST+pcDNA組 、SST+FOXD1組和SST+FOXD1+LY294002組。

1.3 MTT檢測細胞增殖收集生長狀態(tài)良好的PANC-1細胞接種至96孔板中（2×103個/孔），在恒溫培養(yǎng)箱固定培養(yǎng)48 h后，在每孔加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)孵育4 h，出去上清液，繼續(xù)加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），輕輕震蕩混勻，在酶標儀490 nm檢測細胞的光密度（OD）值，并計算半抑制濃度（IC50）值。

1.4 Transwell檢測細胞遷移和侵襲細胞遷移實驗：收集生長狀態(tài)良好的PANC-1細胞在不含胎牛血清培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，消化培養(yǎng)后調(diào)整密度至105個/毫升。在Transwell上室加入200 μL細胞懸液，下室內(nèi)加入500 μL含胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去未成功遷移的細胞，采用4%甲醛固定15 min后，結(jié)晶紫染色，30 min倒置在顯微鏡下觀察遷移細胞數(shù)目。

細胞侵襲實驗：將Matrigel基質(zhì)膠在不含血清培養(yǎng)基稀釋，稀釋比例為1∶3，取200 μL稀釋的Matrigel基質(zhì)膠鋪板于Transwell上室內(nèi)，風(fēng)干5 h，后續(xù)實驗同上述遷移實驗。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測PCNA、MMP-2、MMP-9、FOXD1和PI3K/AKT蛋白的表達收集生長狀態(tài)良好的PANC-1細胞，按照BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入45 μg上樣蛋白經(jīng)過12% SDS-PAGE處理轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后在5%脫脂牛奶封閉培養(yǎng)2 h，加入PCNA（1∶500）、MMP-2（1∶500）、MMP-9（1∶500）、FOXD1（1∶500）、p-PI3K（1∶500）、p-AKT（1∶500）、PI3K（1∶800）、AKT（1∶800）和GAPDH（1∶1 000）抗體，4℃過夜培養(yǎng)，次日加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫下培養(yǎng)2 h，加入ECL試劑顯影，曝光。采用Quantity One軟件掃描各組蛋白條帶的灰度值，然后以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白的表達。

1.6 qRT-PCR檢測FOXD1 mRNA的表達收集各組PANC-1細胞采用Trizol試劑提取細胞的總RNA，紫外分光光度計檢測濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后采用SYBR Green Premix試劑盒說明書進行PCR擴增 。 通 過2-ΔΔCt法 計 算FOXD1 mRNA的 表 達 。FOXD1正向引物5'-AAGAACCCGCTGGTGAAG-3'，反向引物5'-GTCCAGTAGTTGCCCTTGC-3'；GAPDH正向引物5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物5'-GCC ATCACGCCACAGTTTC-3'。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法通過采用SPSS 20.0分析處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料采用表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t方法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的生長抑素對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響隨著不同濃度（0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）的生長抑素處理胰腺癌細胞后，結(jié)果顯示，隨著不同濃度生長抑素的增加，細胞的OD值、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達逐漸降低（P＜0.05）。其中生長抑素為400 mg/L達到半數(shù)抑制（IC50），因此選擇400 mg/L的生長抑素進行后續(xù)實驗。見圖1，表1。

圖1 各組胰腺癌細胞增殖和遷移、侵襲蛋白表達

表1 不同濃度生長抑素對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

表1 不同濃度生長抑素對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

注：SST為生長抑素，OD為光密度，PCNA為增殖細胞核抗原，MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶。①與0 mg/L組相比，P＜0.05。

SST濃度0 mg/L 100 mg/L 200 mg/L 400 mg/L F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 99 OD值（490 nm）1.19±0.09 0.93±0.07①0.71±0.06①0.48±0.05①173.70＜0.001遷移細胞數(shù)目/個132.72±12.28 115.78±11.70①89.32±8.47①63.42±6.71①82.23＜0.001侵襲細胞數(shù)目/個125.56±10.37 106.11±9.52①83.51±7.78①60.23±5.26①100.28＜0.001 PCNA 1.03±0.08 0.84±0.07①0.70±0.06①0.49±0.05①107.38＜0.001 MMP-2 1.02±0.08 0.81±0.07①0.68±0.06①0.45±0.04①124.36＜0.001 MMP-9 0.99±0.07 0.79±0.06①0.64±0.05①0.42±0.04①165.52＜0.001

2.2 生長抑素對胰腺癌細胞FOXD1的表達的影響選擇400 mg/L的生長抑素處理細胞，通過qRTPCR和Western blotting結(jié)果顯示，與Control組相比，SST組的FOXD1 mRNA和蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與SST+pcDNA組 相 比 ，SST+FOXD1組 的FOXD1 mRNA和蛋白表達明顯增加（P＜0.05）。見圖2，表2。

圖2 各組胰腺癌細胞FOXD1蛋白表達

表2 生長抑素對胰腺癌細胞FOXD1表達的影響/

表2 生長抑素對胰腺癌細胞FOXD1表達的影響/

注：Control為對照組，SST為生長抑素組，SST+pcDNA為pcDNA轉(zhuǎn)染組，SST+FOXD1為FOXD1轉(zhuǎn)染組，F(xiàn)OXD1為轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白D1。①與Control組相比，P＜0.05。②與SST+pcDNA組相比，P＜0.05

組別Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重復(fù)次數(shù)9999 FOXD1 mRNA 1.02±0.06 0.47±0.03①0.49±0.04 0.67±0.05②271.64＜0.001 FOXD1蛋白0.99±0.07 0.42±0.04①0.39±0.03 0.64±0.06②250.69＜0.001

2.3 生長抑素聯(lián)合FOXD1對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響與Control組相比，SST組的OD值、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與SST+pcDNA組相比，SST+FOXD1組的OD值、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖3，表3。

表3 FOXD1過表達對生長抑素處理的胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

表3 FOXD1過表達對生長抑素處理的胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

注：Control為對照組，SST為生長抑素組，SST+pcDNA為pcDNA轉(zhuǎn)染組，SST+FOXD1為FOXD1轉(zhuǎn)染組，OD為光密度，PCNA為增殖細胞核抗原，MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶。①與Control組相比，P＜0.05。②與SST+pcDNA組相比，P＜0.05。

組別Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重復(fù)次數(shù)9999 OD值（490 nm）1.15±0.11 0.52±0.05①0.49±0.04 0.71±0.07②158.03＜0.001遷移細胞數(shù)目/個129.32±11.44 66.79±7.22①62.73±6.82 86.88±8.46②111.09＜0.001侵襲細胞數(shù)目/個123.57±11.63 63.72±6.51①65.78±5.59 81.52±7.30②105.95＜0.001 PCNA 1.01±0.08 0.47±0.05①0.45±0.04 0.66±0.06②171.98＜0.001 MMP-2 0.99±0.07 0.43±0.04①0.40±0.03 0.62±0.06②241.09＜0.001 MMP-9 0.97±0.07 0.44±0.05①0.43±0.04 0.67±0.05②201.68＜0.001

圖3 各組胰腺癌細胞增殖及遷移、侵襲蛋白表達

2.4 生長抑素聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT信號通路的表達與Control組相比，SST組的p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與SST+pcDNA組相比，SST+FOXD1組p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖4，表4。

表4 過表達FOXD1對生長抑素處理的胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響/

表4 過表達FOXD1對生長抑素處理的胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響/

注：Control為對照組，SST為生長抑素組，SST+pcDNA為pcDNA轉(zhuǎn)染組，SST+FOXD1為FOXD1轉(zhuǎn)染組，PI3K為磷脂酰肌醇3激酶，p-PI3K為磷酸化磷脂肌醇3激酶，AKT為蛋白激酶B，p-AKT為磷酸化蛋白激酶B。①與Control組相比，P＜0.05。②與SST+pcDNA組相比，P＜0.05。

組別Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重復(fù)次數(shù)9 999 p-PI3K/PI3K 1.03±0.08 0.43±0.04①0.40±0.03 0.62±0.05②265.99＜0.001 p-AKT/AKT 0.99±0.07 0.39±0.03①0.42±0.04 0.65±0.06②251.43＜0.001

圖4 各組胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達

2.5 加入LY294002抑制劑對PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響與SST+FOXD1組相比，SST+FOXD1+LY294002組的p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖5，表5。

表5 LY294002對生長抑素與FOXD1聯(lián)合處理的胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響

圖5 各組胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達

2.6 生長抑素聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT通路對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響與SST+FOXD1組 相 比 ，SST+FOXD1+LY294002組 的FOXD1 mRNA及蛋白表達、OD值、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖6，表6。

表6 LY294002對生長抑素與FOXD1聯(lián)合處理的胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

表6 LY294002對生長抑素與FOXD1聯(lián)合處理的胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

注：SST+FOXD1為FOXD1轉(zhuǎn)染組，SST+FOXD1+LY294002為生長抑素及PI3K抑制劑LY294002處理組，F(xiàn)OXD1為轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白D1，OD為光密度，PCNA為增殖細胞核抗原，MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶。

組別SST+FOXD1 SST+FOXD1+LY294002 t值P值重復(fù)次數(shù)99 FOXD1 mRNA 0.72±0.06 0.37±0.04 14.56＜0.001 FOXD1蛋白0.93±0.05 0.35±0.03 29.84＜0.001 OD值（450 nm）0.69±0.06 0.53±0.05 6.15＜0.001遷移細胞數(shù)目/個83.72±7.20 67.19±6.46 5.13＜0.001侵襲細胞數(shù)目/個78.57±7.52 62.52±5.16 5.28＜0.001 PCNA 1.01±0.07 0.41±0.05 20.93＜0.001 MMP-2 0.97±0.07 0.39±0.04 21.58＜0.001 MMP-9 0.99±0.07 0.44±0.04 20.47＜0.001

圖6 各組胰腺癌細胞FOXD1蛋白及增殖和遷移、侵襲蛋白表達

3 討論

胰腺癌多發(fā)于糖尿病病人和慢性胰腺炎病人，臨床癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹部飽脹不適和消瘦無力等現(xiàn)象，受吸煙、高脂肪、飲酒、飲用咖啡和環(huán)境等因素影響［8-9］。生長抑素作為臨床治療腫瘤和癌癥常見的藥物，在抗癌方面具有一定的作用效果，最早是由Krulich于1968年在大鼠下丘腦生長激素釋放因子，是一種抑制生長激素的物質(zhì)，經(jīng)過Brazeau分離提純［10-11］。生長抑素不僅能減少胰腺、胃小腸和膽囊等分泌，還能夠減少酶活性，對腫瘤細胞具有保護作用，可以作為抗腫瘤的一種藥物［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，生長抑素聯(lián)合吉西他濱抑制胰腺癌細胞增殖［13］。朱威等［14］研究結(jié)果顯示，生長抑素藥物通過下調(diào)環(huán)氧化酶2（Cox-2）抑制胃癌細胞增殖和誘導(dǎo)細胞的凋亡。丁瑞賢［15］研究結(jié)果顯示，生長抑素通過調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白通路抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，結(jié)果不同濃度的生長抑素抑制胰腺癌細胞，結(jié)果顯示，細胞的OD值、遷移細胞數(shù)目和侵襲細胞數(shù)目明顯降低，PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達下調(diào)，說明生長抑素可以明顯抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，具有抗腫瘤的作用。

FOXD1是FOXD家族成員之一，位于染色體5q12區(qū)域，廣泛存在于真核組織和細胞中［16］，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD1在結(jié)直腸癌組中表達上調(diào)，與腫瘤分化程度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后顯著相關(guān)，沉默F(xiàn)OXD1可以抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進其凋亡［17］。Pan等［18］研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD1在大腸癌組織中表達上調(diào)，異常表達與一些臨床表現(xiàn)（腫瘤大小、分化、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）有關(guān)，敲低FOXD1減弱了大腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，生長抑素可以下調(diào)FOXD1 mRNA和蛋白表達，過表達FOXD1可以逆轉(zhuǎn)生長抑素對胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的作用，說明生長抑素通過上調(diào)FOXD1發(fā)揮在胰腺癌細胞中的作用。PI3K家族可以參與多種通路（PI3K、PTEN、AKT）調(diào)控腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移等［19］，Zhang等［20］研究結(jié)果顯示鳶尾素可以通過下調(diào)PI3K/AKT通路抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡。經(jīng)過生長抑素處理細胞后，p-PI3K、p-AKT蛋白表達下調(diào)，過表達FOXD1則上調(diào)p-PI3K、p-AKT蛋白表達，說明生長抑素通過聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT通 路 的 表 達 。 加 入PI3K抑 制 劑LY294002處理后，p-PI3K、p-AKT蛋白表達下調(diào)，細胞的OD值、遷移細胞數(shù)目和侵襲細胞數(shù)目明顯降低，F(xiàn)OXD1 mRNA表達下調(diào)，F(xiàn)OXD1、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達下調(diào)，這說明生長抑素通過聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT通路影響胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，生長抑素通過上調(diào)FOXD1的表達抑制PI3K/AKT通路抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。