表面增強(qiáng)拉曼光譜在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王哲，陳芳，董麗，胡小松

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

食品中廣泛存在著影響公共衛(wèi)生的致病菌，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和志賀氏菌[1]。2015年世界衛(wèi)生組織首個(gè)全球食源性疾病估算報(bào)告顯示，每年大約10人中會(huì)有1人因食源性致病菌而患病，并約有42萬(wàn)人因患病而死亡[2]。因此，檢測(cè)致病菌對(duì)確保人體健康和安全至關(guān)重要。目前，食品中致病菌常用的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[3]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[4]、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）[5]和免疫磁珠分離技術(shù)（immunomagnetic separation，IMS）[6]等。平板計(jì)數(shù)法耗時(shí)耗成本[7]，PCR和LAMP的樣品制備過(guò)程復(fù)雜且需要專(zhuān)業(yè)人員。ELISA雖然快速便捷，但是其結(jié)果往往呈現(xiàn)假陽(yáng)性。盡管IMS具有較高的檢測(cè)靈敏度和較廣的檢測(cè)范圍，但是其價(jià)格昂貴，并且對(duì)抗原靶標(biāo)的特異性要求較高[8]。因此在食品致病菌的檢測(cè)中，迫切地需要一種省時(shí)省力、靈敏度高的方法。

目前，結(jié)合拉曼散射和納米技術(shù)的表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）是一種吸引力高和應(yīng)用前景廣闊的細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)[9]。Moskovits[10]發(fā)現(xiàn)太陽(yáng)光被散射后，散射光的頻率會(huì)發(fā)生變化，這種現(xiàn)象被命名為拉曼散射。散射光頻率的變化取決于不同種類(lèi)原子團(tuán)的獨(dú)一性振動(dòng)，這使得拉曼散射的光譜具有“指紋”特性。自然狀態(tài)下的拉曼散射非常弱，使拉曼光譜的實(shí)際應(yīng)用受到限制。隨著激光器的發(fā)展，自然狀態(tài)下拉曼信號(hào)弱的問(wèn)題得到改善[11]。Katan等[12]發(fā)現(xiàn)吸附在銀電極上的吡啶的拉曼光譜中存在顯著增強(qiáng)的效應(yīng)。Albrecht等[13]發(fā)現(xiàn)表面效應(yīng)將吡啶分子的拉曼信號(hào)放大了約105倍。至今，針對(duì)SERS增強(qiáng)機(jī)理和基底制備的研究以及拉曼設(shè)備的研發(fā)已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，這使SERS技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)、微生物及其代謝物等方面的研究。本文在簡(jiǎn)要總結(jié)SERS的增強(qiáng)機(jī)制和基底類(lèi)別的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)概述SERS技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用，為今后SERS技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供參考。

1 SERS的增強(qiáng)機(jī)理

目前，學(xué)術(shù)界關(guān)于SERS的增強(qiáng)機(jī)理中被廣泛接受的是電磁增強(qiáng)（electromagnetic enhancement，EM）和化學(xué)增強(qiáng)（chemical enhancement，CM）[14-15]。電磁增強(qiáng)是當(dāng)光線(xiàn)入射到粗糙的金屬表面時(shí)造成局部表面等離子體共振，進(jìn)而引起拉曼信號(hào)的放大[16]?；瘜W(xué)增強(qiáng)是由于SERS金屬基底與吸附分子之間存在著特殊的化學(xué)相互作用，在入射光的激發(fā)下，基底和吸附分子之間產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移，如果入射光子和轉(zhuǎn)移電子的能量差等于金屬基底與吸附分子之間的能量差，會(huì)引發(fā)共振，最終增強(qiáng)拉曼信號(hào)[17]。大多數(shù)人認(rèn)為在增強(qiáng)體系中兩種機(jī)理起協(xié)同作用，但電磁增強(qiáng)處于主導(dǎo)地位[18]。在激光的作用下，高強(qiáng)度的局域電場(chǎng)在貴金屬納米顆粒的間隙形成，稱(chēng)為“熱點(diǎn)”[19]。在致病菌檢測(cè)中，金屬納米材料通過(guò)靜電吸附或適配體特異性識(shí)別結(jié)合在致病菌的表面，納米材料之間形成的“熱點(diǎn)”明顯放大了致病細(xì)菌或拉曼標(biāo)簽的分子信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的直接或間接檢測(cè)。

2 SERS的基底材質(zhì)

目前，SERS基底按材料組成的復(fù)雜程度一般分為兩類(lèi)：?jiǎn)谓饘倩缀图{米復(fù)合基底[20]。其中納米復(fù)合基底的檢測(cè)靈敏度相對(duì)較高，但制備步驟繁瑣；單金屬基底制備簡(jiǎn)單，但靈敏度略顯不足。

2.1 單金屬基底

通常，用于SERS檢測(cè)的金屬基底主要是金（Au）、銀（Ag）、銅（Cu）等[21-23]。除材料因素外，金屬納米顆粒的SERS增強(qiáng)效應(yīng)還與納米顆粒的大小、形狀和聚集程度相關(guān)[24]。Frens[25]研究檸檬酸鹽還原法制備金納米顆粒（gold nanoparticles，Au NPs），為后來(lái) SERS 金屬基底的制備提供參考。Luo等[26]分別制備直徑為64 nm和102 nm的Au NPs用以對(duì)蘋(píng)果中廣泛使用的亞胺硫磷和噻苯達(dá)唑的快速分析。其中亞胺硫磷的檢測(cè)限為0.5 μg/g，噻苯達(dá)唑的檢測(cè)限為 0.1 μg/g，檢測(cè)范圍分別為 0.5 μg/g～10.0 μg/g 和 0.1 μg/g～5.0 μg/g，線(xiàn)性相關(guān)度達(dá)到了0.967和0.977，回收率超過(guò)90%，在食品檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用潛力。陶進(jìn)江等[27]以Au NPs為增強(qiáng)基底、硫酸鎂為活化劑，并以819cm-1處特征峰作為己烯雌酚（dieth-ylstilbestrol，DES）的拉曼特征峰，測(cè)定鴨肉中DES的含量，檢測(cè)限低至0.5 mg/L，平均回收率為83%～133%，可實(shí)際應(yīng)用于鴨肉中DES含量的檢測(cè)。相較于AuNPs，AgNPs具有更強(qiáng)大的SERS增強(qiáng)能力，但AuNPs生物相容性更高、穩(wěn)定性更高，不容易被氧化[28]。

2.2 納米復(fù)合基底

近年來(lái)，納米復(fù)合基底因其更強(qiáng)的信號(hào)增強(qiáng)作用和更好的生物兼容性逐漸成為主流基底，主要包括雙金屬和金屬-非金屬兩種形式[20]。

2.2.1 雙金屬基底

雙金屬基底結(jié)合了Au、Ag納米粒子的特性，在具有強(qiáng)大的SERS增強(qiáng)能力的同時(shí)具有高度的穩(wěn)定性。李夢(mèng)華[29]先以檸檬酸鈉還原法制備Au NPs金種子，再通過(guò)抗壞血酸還原AgNO3得到金核銀殼的納米粒子（Au@Ag NPs），用以檢測(cè)面粉中的偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，ADA）。其原理是 ADA 依靠-NH2與Au@Ag NPs的強(qiáng)吸附作用結(jié)合在復(fù)合基底的表面。使用該方法檢測(cè)限可達(dá)到0.58 mg/kg，遠(yuǎn)低于GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定要求（≤45mg/kg），且操作簡(jiǎn)單快速，前處理時(shí)間不到20min。

2.2.2 金屬/半導(dǎo)體納米復(fù)合基底

由于自身具有較高的比表面積，目前半導(dǎo)體納米材料已經(jīng)作為一種SERS基底引起了廣泛的關(guān)注[20]。常見(jiàn)的具有表面增強(qiáng)拉曼效果的半導(dǎo)體材料有TiO2[30]和ZnO[31]。李耕等[32]通過(guò)水熱反應(yīng)，用NaOH溶液成功制備原位生長(zhǎng)的TiO2納米線(xiàn)，并在其表面均勻鍍銀，得到Ag/TiO2復(fù)合基底。通過(guò)對(duì)3種有機(jī)污染物孔雀石綠（malachite green，MG）、羅丹明B和福美雙的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該基底具有良好的拉曼信號(hào)增強(qiáng)能力。劉肖等[33]結(jié)合ZnO的光催化性能、高比表面積以及Ag的拉曼信號(hào)增強(qiáng)作用制備了ZnO/Ag復(fù)合薄膜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)低濃度羅丹明B（10-9mol/L）的有效檢測(cè)。

2.2.3 金屬-二維材料復(fù)合基底

二維材料具有一種特殊的二維平面，該平面可以限制載流子遷移和熱量擴(kuò)散，因此二維材料具有其他材料所沒(méi)有的獨(dú)特性質(zhì)。目前常見(jiàn)的二維材料有石墨烯和二硫化鉬[34]。張朋月等[35]以硅片作為襯底，在硅片SiO2鍍層的基礎(chǔ)上，再?lài)娚銫u、Ag兩層金屬膜，其中Cu位于Ag的上層，之后利用化學(xué)氣相沉積法（chemical vapor deposition，CVD）在Cu基底表面原位生長(zhǎng)出石墨烯。在以羅丹明6G（rhodamine 6G，R6G）為探針?lè)肿訒r(shí)，增強(qiáng)因子能夠達(dá)到107。此外，石墨烯還可以保護(hù)金屬不被氧化，提高了基底的均勻程度和穩(wěn)定性。

2.2.4 金屬-聚合物復(fù)合基底

研究顯示，由金屬納米顆粒和聚合物組成的混合表面可能有助于產(chǎn)生更重要的細(xì)菌SERS信號(hào)[36]。吳煥樂(lè)等[37]通過(guò)葡萄糖還原AgNO3制備銀納米顆粒，并使其沉積在聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）薄片的表面，生成PDMS-Ag復(fù)合基底。該方法對(duì)MG的檢測(cè)限低至0.1 mol/L，當(dāng)以魚(yú)肉的MG為檢測(cè)對(duì)象時(shí)，孔雀石綠加標(biāo)回收率為96.4%～128.4%，可以應(yīng)用于魚(yú)肉中MG的靈敏檢測(cè)。Cao等[38]制備了覆蓋Au NPs的大面積多孔聚合物薄層，用作細(xì)菌鑒定中的靈敏SERS基底。該基底在可重復(fù)利用的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的有效感知和捕獲。

3 SERS在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

目前應(yīng)用于微生物檢測(cè)的SERS技術(shù)一般分為兩種：無(wú)標(biāo)簽SERS檢測(cè)和有標(biāo)簽SERS檢測(cè)，即直接檢測(cè)和間接檢測(cè)。在直接檢測(cè)中，納米基底與微生物通過(guò)靜電引力相互吸附，可以直接獲得目標(biāo)分子的SERS光譜。間接檢測(cè)的拉曼標(biāo)簽則由納米基底和拉曼信號(hào)分子組成，通過(guò)適配體、抗體或噬菌體等具有高度特異性地捕獲元素來(lái)捕捉目標(biāo)細(xì)菌，并將其和拉曼標(biāo)簽相連接，以拉曼信號(hào)分子的特征峰來(lái)間接定量微生物濃度。SERS識(shí)別細(xì)菌常見(jiàn)方法的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1，用于SERS檢測(cè)細(xì)菌的拉曼信號(hào)分子見(jiàn)表2。

表1 SERS識(shí)別細(xì)菌常見(jiàn)方法的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of common methods of SERS to identify bacteria

表2 用于SERS檢測(cè)細(xì)菌的拉曼信號(hào)分子Table 2 Raman signal molecules used in SERS to detect bacteria

3.1 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是一種兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性球菌，擁有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和傳播性[48-50]，廣泛存在于乳及乳制品和肉及肉制品中[51]。其產(chǎn)生的腸毒素可導(dǎo)致腹瀉、嘔吐等急性毒性癥狀[52]，研究表明，皮炎、菌血癥和感染性心內(nèi)膜炎等疾病均與金黃色葡萄球菌有關(guān)[53]，在嚴(yán)重情況下，它還會(huì)導(dǎo)致感染者死亡[54]。

Liu等[41]以生物兼容性高的金納米棒為拉曼探針，通過(guò)羧基化的磁性捕捉探針來(lái)富集金黃色葡萄球菌。首先利用Fe-MIL-88納米酶的表面吸附性質(zhì)，通過(guò)加入適配體達(dá)到對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性識(shí)別；同時(shí)利用Fe-MIL-88納米酶的催化能力，將無(wú)色孔雀石綠（leucomalachite green，LMG）催化為有強(qiáng)SERS信號(hào)（1 168 cm-1處有特征峰），且在620 nm處有紫外可見(jiàn)光（ultraviolet-visible，UV-Vis）吸光度的綠色孔雀石綠（MG）；最后應(yīng)用SERS光譜學(xué)和分光光度計(jì)，間接檢測(cè)了10 CFU/mL～1×106CFU/mL范圍內(nèi)的金黃色葡萄球菌。該方法所使用的捕捉探針為羧基化磁性捕捉探針，相比于普通磁性捕捉探針，有著富集效果穩(wěn)定和合成方法穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。而且該方法所用的人工制備的Fe-MIL-88納米酶穩(wěn)定、廉價(jià)、易于合成。此外，該方法檢測(cè)到的金黃色葡萄球菌含量幾乎與傳統(tǒng)的生物平板計(jì)數(shù)方法相同，可信度高，且由于適配體與金黃色葡萄球菌之間的高親和力使得該方法對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的特異性。

Zhu等[44]基于PDMS薄膜，通過(guò)兩步組裝與Au NPs共軛形成Au NPs-PDMS。首先使用食人魚(yú)溶液和3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）對(duì)PDMS薄膜表面進(jìn)行化學(xué)修飾，通過(guò)靜電吸附作用制備Au NPs-PDMS薄膜。然后，硫醇端適配體通過(guò)金硫鍵固定在Au NPs-PDMS膜上，形成捕獲基質(zhì)。同時(shí)采用4-MBA修飾金芯銀殼納米管（gold-silrer core-shell nanoflowers，Au@Ag NFs），將功能化的Au@Ag NFs@4-MBA作為SERS信號(hào)探針來(lái)表達(dá)金黃色葡萄球菌的拉曼信號(hào)，4-MBA在1 085 cm-1處有拉曼特征峰產(chǎn)生，可通過(guò)測(cè)量4-MBA的SERS強(qiáng)度來(lái)量化金黃色葡萄球菌的濃度。在目標(biāo)底物存在的情況下，信號(hào)分子探針和捕獲基質(zhì)與目標(biāo)底物特異性結(jié)合，從而形成了“捕獲基底-目標(biāo)底物-分子探針”的“三明治”結(jié)構(gòu)。該方法具有良好的特異性，可特別應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，檢測(cè)范圍為4.3×10 CFU/mL～4.3×107CFU/mL，檢測(cè)限為13 CFU/mL，以魚(yú)肉為檢測(cè)樣品時(shí)該方法的回收率為92.5%～110%。

Wang等[45]構(gòu)建了一種基于M13噬菌體的表面增強(qiáng)型拉曼散射納米探針，用于金黃色葡萄球菌的選擇性檢測(cè)和滅活。M13噬菌體的pⅢ蛋白可以和金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合，同時(shí)，它的pVIII蛋白作為Au NPs原位生長(zhǎng)的共軛配體，為Au NPs在M13噬菌體表面原位生長(zhǎng)提供了條件。之后用拉曼活性分子DTNB標(biāo)記Au NPs完成M13-SERS探針的構(gòu)建。加入該探針后，M13噬菌體選擇性地與金黃色葡萄球菌結(jié)合，使Au NPs錨定在金黃色葡萄球菌表面。由于單個(gè)菌體可以被多個(gè)M13-SERS探針標(biāo)記，同時(shí)每個(gè)探針裝配有多個(gè)Au NPs，因此拉曼信號(hào)可以被極大地放大。離心收集SERS探針標(biāo)記的金黃色葡萄球菌，并通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記在Au NPs上的DTNB在1 331 cm-1處的特征峰的強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌濃度的量化。該方法在水介質(zhì)中的檢測(cè)限為10 CFU/mL～1×106CFU/mL，回收率為103.3%～110.0%，具有較高的實(shí)際應(yīng)用性。此外，該方法檢測(cè)時(shí)間較短，所用M13噬菌體對(duì)人體無(wú)害并可廉價(jià)純化[55-56]，同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌有良好的選擇性和滅活能力。

3.2 大腸桿菌O157：H7

大腸桿菌O157：H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，革蘭氏染色呈陰性，是主要的食源性病原體之一[57]。它產(chǎn)生的志賀氏毒素可感染水、牛奶、水果和蔬菜[58-59]，引起腹瀉、溶血性尿毒癥等不良癥狀[60]，從而造成嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題[61]。

Shi等[62]合成了一種分散性好、穩(wěn)定性高、SERS活性?xún)?yōu)異的新型金殼硅芯納米球（SiO2/Au NPs），并作為高性能大腸桿菌檢測(cè)標(biāo)簽引入側(cè)流免疫層析（lateral flow immunochromatography assay，LFIA）系統(tǒng)。首先，聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）在 SiO2的表面自組裝，使SiO2的表面布滿(mǎn)大量的正電荷，通過(guò)靜電吸附結(jié)合金納米“種子”，同時(shí)，PEI暴露出氨基來(lái)結(jié)合DTNB，從而合成SiO2/seed/DTNB NPs。隨后加入聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和 HAuCl4促進(jìn)金納米“種子”的生長(zhǎng)，形成SiO2/DTNB/Au NPs。最后用DTNB乙醇溶液修飾SiO2/DTNB/Au NPs得到雙DTNB 修飾的 SiO2/Au NPs（SiO2/DTNB/Au/DTNB NPs），位于外層的DTNB-COOH與大腸桿菌O157：H7抗體的酰胺基結(jié)合形成SERS高性能標(biāo)簽。在磷酸緩沖鹽溶液中，基于SiO2/Au NPs的SERS-LFIA帶的檢測(cè)限為50 CFU/mL，以自來(lái)水、牛奶、生菜提取物和牛肉為樣品時(shí)，檢測(cè)限為100CFU/mL。當(dāng)細(xì)菌濃度在50 CFU/mL～1×107CFU/mL時(shí)，該方法與細(xì)菌濃度呈良好的正線(xiàn)性相關(guān)。試驗(yàn)時(shí)間短、操作方便、重現(xiàn)性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)也賦予了該方法快速檢測(cè)食品中致病菌的良好潛力。

You等[63]通過(guò)在殼聚糖涂層淀粉磁珠（chitosancoated starch magnetic beads，CS@SMBs）表面原位合成金納米顆粒（Au NPs）來(lái)制備金納米顆粒涂層淀粉磁珠（Au NPs@SMBs）。作為固定特異性抗體的底物，Au NPs@SMBs表面密集的金納米粒子為增強(qiáng)電磁場(chǎng)提供了有效的“熱點(diǎn)”，從而放大目標(biāo)細(xì)菌存在時(shí)產(chǎn)生的SERS信號(hào)。之后使用4×金結(jié)合肽標(biāo)記鏈球菌蛋白G（4×gold-binding peptide-tagged streptococcal protein G，4GS）連接SERS基底和目標(biāo)細(xì)菌，而且4GS還可以作為一種有效的拉曼報(bào)告分子，在SERS測(cè)量過(guò)程中表現(xiàn)出強(qiáng)大而獨(dú)特的拉曼信號(hào)。當(dāng)濃度范圍為1 CFU/mL～105CFU/mL時(shí)，該方法具有良好線(xiàn)性相關(guān)性，檢測(cè)限低至1 CFU/mL。

3.3 鼠傷寒沙門(mén)氏菌

鼠傷寒沙門(mén)氏菌是一種腸桿菌科革蘭氏陰性細(xì)菌[64]，在肉制品、乳制品以及蛋中均有檢出，可造成膽囊炎等多種疾病[65]，是對(duì)人類(lèi)最危險(xiǎn)的食源性病原體之一[66]。

Li等[42]提出了一種有效的雙信號(hào)擴(kuò)增方法，將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction，HCR）與SERS相結(jié)合，雙信號(hào)級(jí)聯(lián)放大提高了對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度。首先鼠傷寒沙門(mén)氏菌被免疫磁珠（impeti cbead，IMB）捕獲，而后IMB通過(guò)抗原抗體免疫反應(yīng)打開(kāi)適配體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)并暴露觸發(fā)序列，隨后發(fā)夾探針H1和H2交替打開(kāi)莖環(huán)結(jié)構(gòu)并相互補(bǔ)充，形成HCR產(chǎn)物雙鏈脫氧核糖核苷酸（dsDNA）。之后加入過(guò)量的DAPI作為拉曼信號(hào)分子與HCR產(chǎn)物進(jìn)行培養(yǎng)，再將整個(gè)系統(tǒng)與Ag NPs膠體混合。嵌入dsDNA的AT堿基之間的DAPI幾乎沒(méi)有拉曼信號(hào)，而由于靜電相互作用沒(méi)有與HCR產(chǎn)物反應(yīng)的DAPI可以附著在Ag NPs基質(zhì)之間，形成大量的“熱點(diǎn)”，在1 610 cm-1處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的SERS信號(hào)。該方法中SERS信號(hào)與細(xì)菌濃度呈負(fù)相關(guān)，用于檢測(cè)樣品鼠沙門(mén)氏菌的數(shù)量，檢測(cè)限低至6 CFU/mL，以牛奶為樣品時(shí)回收率在103.08%～104.88%之間。

Yang等[67]提出了一種基于三維DNA漫步器的SERS方法，用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的定量分析。在鼠傷寒沙門(mén)氏菌存在的情況下，鼠傷寒沙門(mén)氏菌識(shí)別適配體（Salmomella typhinurium-recognizing aptamer，cApt）從Apt@cApt中釋放。隨后游離的cApt基于互補(bǔ)堿基配對(duì)原則打開(kāi)附著在金磁性納米顆粒（gold magnetic nanoparticles，Au MNPs） 上的聚腺嘌呤 DNA（poly-ade nine-DNA，ployA-DNA）序列，形成 ployA-DNA@cApt。同時(shí)，SERS標(biāo)簽通過(guò)堿基互補(bǔ)與Au MNPs表面的酶片段結(jié)合形成Au MNPs@SERS，將該復(fù)合物進(jìn)行磁性分離和SERS檢測(cè)，當(dāng)以R6G為信號(hào)分子時(shí)，發(fā)現(xiàn)位于1 514 cm-1處峰值的SERS強(qiáng)度始終最強(qiáng)。隨著細(xì)菌數(shù)量的增加，更多的cApt序列被取代，導(dǎo)致更多的ployA-DNA被打開(kāi)。經(jīng)過(guò)酶水解和DNA漫步器循環(huán)后，可以與SERS標(biāo)簽結(jié)合的酶片段的數(shù)量增加，從而放大SERS信號(hào)。由于信號(hào)放大，該方法檢測(cè)限低至4 CFU/mL。此外，這個(gè)SERS檢測(cè)方法具有快速、低成本、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）的變化范圍分別為96.04%～112.87%和5.69%～11.46%。

Prakash等[68]制備了一種帶正電荷的無(wú)標(biāo)簽的Ag/Au雙金屬納米顆粒（Ag/Au bimetallic nanoparticles，Ag/Au bmNPs）基底，可用來(lái)直接捕獲并檢測(cè)目標(biāo)菌樣的拉曼信號(hào)。相比于單金屬納米基底，多金屬納米基底增強(qiáng)了局部表面等離子體振動(dòng)、催化性能和SERS“熱點(diǎn)”的可用性，且操作簡(jiǎn)單、靈敏度高[69-73]?；跓o(wú)標(biāo)簽的細(xì)菌的SERS特征主要來(lái)自細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)成分，因此可利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和典型判別分析（canonical discriminant analysis，CDA）等多元分析來(lái)區(qū)分鼠傷寒沙門(mén)氏菌和其他細(xì)菌[74-75]。

3.4 單核細(xì)胞增生李斯特菌

單核細(xì)胞增生李斯特菌是最常見(jiàn)的腸病原體之一[76]，存在于乳制品、肉制品和海產(chǎn)品等各類(lèi)食品中[75，77]，可引起腸胃炎、敗血病、腦膜炎等多種疾病[78]。

Zhou等[79]提出了一種磁輔助SERS標(biāo)簽的免疫檢測(cè)方法。首先利用PEI介導(dǎo)的種子生長(zhǎng)方法，選擇強(qiáng)磁響應(yīng)性強(qiáng)和穩(wěn)定性良好的Fe4作為超順磁核來(lái)合成Fe4@Au MNPs，并將其用作磁捕獲工具和SERS基底。將Fe4@Au MNPs在巰基十一烷酸（mercaptoundecanoic acid，MUA）乙醇溶液中超聲處理使MUA分子覆蓋在Au殼表面，之后加入氨基適配體共聚在Fe4@Au的MUA涂層，形成Fe4@Au適配體。SERS標(biāo)簽的制備需要先將DTNB分子修飾到Au表面，在其產(chǎn)生特征SERS信號(hào)的同時(shí)提供與葡萄球菌蛋白A（Staphylococcus proteins A，SPA）共軛的末端羧基，形成Au-SPA SERS標(biāo)簽。Au-SPA SERS標(biāo)簽不僅具有與Au-DTNB NPs相同的SERS能力（可以在1 331 cm-1處顯示出強(qiáng)烈的拉曼峰值），還因SPA上的Fc區(qū)域?qū)崿F(xiàn)與抗體的特異性結(jié)合。檢測(cè)時(shí)首先將單核細(xì)胞增生李斯特菌和Fe4@Au-aptamer MNPs共同孵育，在細(xì)菌被捕獲后，加入抗體再次孵育。之后加入Au-SPA SERS標(biāo)簽與抗體特異性結(jié)合形成Fe4@Au/細(xì)菌/SERS標(biāo)簽復(fù)合物，對(duì)其檢測(cè)拉曼信號(hào)，當(dāng)細(xì)菌濃度在10 CFU/mL～107CFU/mL之間時(shí)，SERS信號(hào)與細(xì)菌數(shù)量成正比。該方法制備的Fe4@Au-MNPs對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的捕獲率為77.8%，檢測(cè)限為10 CFU/mL。此外，該方法針對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限分別為10 CFU/mL和25 CFU/mL，F(xiàn)e4@Au MNPs對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的捕獲率分別為86.9%和75.7%，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種菌的同時(shí)檢測(cè)。

Liu等[80]開(kāi)發(fā)了一種基于SERS的LFIA與重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）相結(jié)合的技術(shù)，用于同時(shí)檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌和腸炎沙門(mén)氏菌。在該系統(tǒng)中，使用AuMBA@Ag NPs作為標(biāo)簽使2-巰基苯甲酸（thiosalicylic acid，MBA）信號(hào)大大增加，用共焦微拉曼光譜系統(tǒng)測(cè)量MBA在LFIA測(cè)試線(xiàn)上的SERS信號(hào)，在最佳條件下，單核細(xì)胞增生李斯特菌和腸炎沙門(mén)氏菌在1 077 cm-1處的拉曼信號(hào)與細(xì)菌濃度呈正比，檢測(cè)限分別為19 CFU/mL和27 CFU/mL。該方法具有很高的特異性和適用性，可以快速、定量地檢測(cè)食品樣本中的細(xì)菌病原體。

3.5 志賀氏菌

志賀氏菌是一種腸桿菌科的革蘭氏陰性棒狀致病菌，可通過(guò)受污染的水和食品侵染人的結(jié)腸[81]，引起腹瀉和溶血性尿毒癥綜合癥等腸道疾病[82]。目前，全球每年仍有超過(guò)16萬(wàn)例志賀氏菌死亡病例[83]。

Wu等[84]構(gòu)建了一種基于適配體的傳感器，通過(guò)SERS分析對(duì)志賀氏菌進(jìn)行敏感和高度特異性檢測(cè)。首先以 EuCl3·6H2O、1，10-菲羅啉以及 4-MBA 合成[Eu（phen）2（MBA）2]Cl，然后通過(guò)巰基結(jié)合導(dǎo)致Au NPs二聚化，形成Au NPs二聚體，并在“熱點(diǎn)”處獲得了極大的電磁場(chǎng)增強(qiáng)。之后適配體通過(guò)Au-s鍵結(jié)合修飾到AuNPs二聚體的表面。適配體功能化的Au NPs二聚體除了作為捕獲探針外，由于其4-MBA成分，在1 086 cm-1和1 593 cm-1處有與4-MBA一致的兩個(gè)拉曼特征峰，因此還被用作信號(hào)探針。隨著志賀氏菌的引入，通過(guò)適配體使具有雙重功能的Au NPs二聚體修飾在細(xì)菌上，在10 CFU/mL～106CFU/mL的濃度范圍內(nèi)，SERS強(qiáng)度反應(yīng)顯示出很強(qiáng)的正線(xiàn)性相關(guān)（R=0.996），檢測(cè)限低至10 CFU/mL，當(dāng)應(yīng)用于實(shí)際樣品中時(shí)，該方法的回收率為92.6%～103.8%。Au NPs二聚體制備簡(jiǎn)單、低成本可以為SERS的傳感器的構(gòu)建提供一種有效的途徑。不同SERS基底檢測(cè)食源性致病菌的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表3。

表3 不同SERS基底檢測(cè)食源性致病菌的優(yōu)缺點(diǎn)Table 3 The advantages and disadvantages of different SERS substrates for detecting food-borne pathogens

4 展望

SERS具有高靈敏度、快速、所需樣品少、不受水干擾、特異性好以及無(wú)損性等特點(diǎn)，近年來(lái)已成為基于標(biāo)簽和無(wú)標(biāo)簽的食源性致病菌檢測(cè)方法。但是仍有一些問(wèn)題需要解決。1）目前所用的SERS基底多為貴金屬和其他復(fù)合物材料，價(jià)格昂貴且重復(fù)利用率低，高昂的成本一定程度上限制了SERS技術(shù)的發(fā)展，因此需要開(kāi)發(fā)出更多成本較低的基底材料，如半導(dǎo)體材料和磁性材料等。2）目前基于SERS的食品致病菌檢測(cè)環(huán)境多為液體環(huán)境，且在復(fù)雜的真實(shí)環(huán)境中存在其他因素的干擾，因此需要探索開(kāi)發(fā)在多種環(huán)境下可以實(shí)現(xiàn)捕獲并檢測(cè)致病菌的SERS活性基底，或是將SERS與其他技術(shù)相結(jié)合，以提高檢測(cè)性能。3）目前納米顆粒的制備技術(shù)仍無(wú)法保證納米粒子的均一性，使得SERS基底的重現(xiàn)性較低且保存時(shí)間較短。4）雖然目前運(yùn)用SERS檢測(cè)的微生物的種類(lèi)越來(lái)越多，但是仍沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)來(lái)驗(yàn)證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，因此，需要建立針對(duì)微生物的SERS標(biāo)準(zhǔn)。5）目前大多數(shù)拉曼儀器過(guò)于笨重，只適用于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)，很難實(shí)現(xiàn)針對(duì)食品實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，功能多樣、價(jià)格低廉、小巧靈活的拉曼設(shè)備的研發(fā)也是目前需要解決的問(wèn)題之一。盡管目前仍有很多的困難和挑戰(zhàn)，但是隨著相關(guān)儀器技術(shù)和整個(gè)學(xué)科的不斷發(fā)展，SERS在食品中致病菌的檢測(cè)將擁有一個(gè)廣闊的前景。