利用不同啟動(dòng)子調(diào)控啤酒酵母產(chǎn)醇酯比的研究

崔丹瑤，慕濟(jì)鍺，張卜升，郭立蕓，謝鑫，劉小二，林良才，張翠英*

（1.省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101300）

啤酒是世界上最受消費(fèi)者歡迎的酒精飲料之一。水、麥芽、谷物、啤酒花和酵母菌是釀造啤酒的主要原料，在釀造過(guò)程中，谷物中的可利用糖類被酵母菌轉(zhuǎn)化成乙醇、二氧化碳，同時(shí)生成復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)[1]。啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)含量雖然相對(duì)較低，但種類豐富，目前已檢測(cè)出了約1 000種[2]。普遍認(rèn)為高級(jí)醇和酯類物質(zhì)是啤酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)啤酒的香氣與品質(zhì)具有重要的影響[3-5]。高級(jí)醇使啤酒的酒體更加醇厚、豐滿，提高酒的品質(zhì)；酯類物質(zhì)賦予了啤酒特殊的芳香氣味，有助于提高酒的香氣[6]。相關(guān)研究表明，啤酒中高級(jí)醇與酯類含量比例在3∶1～4∶1之間較為適宜[7]。醇酯比過(guò)高或過(guò)低均會(huì)引起風(fēng)味失調(diào)，繼而對(duì)啤酒的品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[8]。

為了提高啤酒的口感與品質(zhì)，許多學(xué)者通過(guò)改變啤酒發(fā)酵的工藝參數(shù)來(lái)調(diào)整高級(jí)醇與酯類物質(zhì)的生成量和比例。劉連成[9]和劉明麗等[10]的研究均證明了提高啤酒酵母的接種量會(huì)降低高級(jí)醇生成量，從而間接降低啤酒的醇酯比。鐘成等[11]利用濃度為11°P和14°P的麥汁分別進(jìn)行啤酒發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)麥汁濃度的提升有助于乙酸乙酯含量的提高。Sun等[12]將啤酒的發(fā)酵溫度由10℃提升至25℃后，正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量明顯提高，同時(shí)發(fā)酵周期從192h縮短為72h。

除改變工藝參數(shù)外，劉玉蘭等[13]選育出一株過(guò)表達(dá)醇乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因ATF1，同時(shí)缺失支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因BAT2的啤酒酵母菌株，其總酯生成量較出發(fā)菌株提高了7.9倍。然而，突變株釀造的啤酒醇酯比僅為0.9∶1，這帶來(lái)了醇酯比失調(diào)的隱患。為了更好地調(diào)控啤酒醇酯比，本研究利用3種不同的啟動(dòng)子（TEF1p、VPS8p、ATF1p）分別構(gòu)建過(guò)表達(dá) ATF1基因的啤酒酵母突變株。對(duì)3株突變株的生長(zhǎng)性能和發(fā)酵性能進(jìn)行全面評(píng)估，通過(guò)啤酒發(fā)酵試驗(yàn)，探究不同啟動(dòng)子對(duì)啤酒醇酯比的調(diào)控效果，為啤酒酵母工程菌株的選育與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

下面發(fā)酵酵母（Saccharomyces pastorianus）S5、大腸桿菌Escherichia coli DH5α、質(zhì)粒：天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。本研究涉及到的菌株與質(zhì)粒信息見(jiàn)表1。

表1 本研究中的菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this study

1.1.2 引物

本研究中的引物均列于表2。引物由Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物中的酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)注。

表2 本研究涉及的引物Table 2 Primers used in this study

續(xù)表2 本研究涉及的引物Continue table 2 Primers used in this study

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，121℃滅菌15 min。

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，121℃滅菌15 min。篩選酵母重組菌株時(shí)，在YEPD培養(yǎng)基中添加硫酸鹽遺傳霉素溶液（G418）至400 μg/mL。

麥芽汁培養(yǎng)基：稱取500 g粉碎后的麥芽，加入2 000 mL蒸餾水，料水比為 1∶4（g/mL），65℃糖化 2 h后過(guò)濾并離心，用糖度計(jì)調(diào)至12°Brix，115℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.4 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、Primer STAR DNA聚合酶、連接酶：TaKaRa（大連）公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒：Omega Bio-Tek（美國(guó)）公司；乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇標(biāo)準(zhǔn)品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

TgL-16C高速離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠；Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀：芬蘭OY GrowthCurves公司；7890A型氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；TD32糖度計(jì)：上海力辰邦西儀器科技有限公司；ZXJD-A1270恒溫培養(yǎng)箱：上海智城分析儀制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

以啤酒酵母菌株S5基因組為模板，使用引物TEF1-F/TEF1-R、VP-F/VP-R和AP-F/AP-R進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），分別得到啟動(dòng)子片段TEF1p、VPS8p、ATF1p。以質(zhì)粒pUC-PABBK和pUG6為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別得到片段ATF1-PGK1t和KanMX。將啟動(dòng)子TEF1p和VPS8p分別與片段ATF1-PGK1t進(jìn)行融合，構(gòu)建片段TEF1p-ATF1-PGK1t和 VPS8p-ATF1-PGK1t。

利用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sma I對(duì)片段TEF1p-ATF1-PGK1t和 VPS8p-ATF1-PGK1t進(jìn)行酶切處理，與經(jīng)相同酶切處理的質(zhì)粒pUC-BB進(jìn)行連接，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-BBTP和pUC-BBVP。最后這兩個(gè)質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶Kpn I線性化后分別與片段KanMX相連接，PCR驗(yàn)證后即獲得了重組質(zhì)粒pUCBBTPK與pUC-BBVPK。

利用限制性內(nèi)切酶Sma I對(duì)片段ATF1-PGK1t和質(zhì)粒pUC-BB進(jìn)行酶切并連接，獲得質(zhì)粒pUC-BBAP。用Pst I對(duì)片段ATF1p進(jìn)行單酶切后，與線性化質(zhì)粒pUC-BBAP連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-BBAAP。最后，經(jīng)Kpn I酶切后的質(zhì)粒pUC-BBAAP與經(jīng)相同處理的片段KanMX連接，PCR驗(yàn)證后即獲得了重組質(zhì)粒pUC-BAAPK。

1.2.2 啤酒酵母菌株的轉(zhuǎn)化

分別以質(zhì)粒pUC-BBTPK、pUC-BBVPK和pUCBAAPK為模板，BQ-F/BQ-R為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得表達(dá)盒BA-TEF1p-ATF1-PGK1t-loxP-KanMX-loxPBB（5 219 bp）、BA-VPS8p-ATF1-PGK1t-loxP-KanMX-loxP-BB（5 251 bp）、BA-loxP-KanMX-loxP-ATF1p-ATF1-PGK1t-BB（5 502 bp）。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將目的片段轉(zhuǎn)化至啤酒酵母中，經(jīng)稀釋后涂布于含有G418抗性（400μg/mL）的YEPD平板上，30℃靜置培養(yǎng)48h[14]。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，正確的轉(zhuǎn)化子經(jīng)純化后保存于YEPD固體斜面中。根據(jù)重組菌株中啟動(dòng)子元件的不同，將菌株分別命名為S5-T（TEF1p）、S5-V（VPS8p）、S5-A（ATF1p）。

1.2.3 啤酒發(fā)酵

首先取斜面菌種一環(huán)，接種于含有5 mL麥汁培養(yǎng)基的試管中，于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。隨后將5 mL培養(yǎng)液傾倒至含有45 mL麥汁培養(yǎng)基的錐形瓶（150 mL規(guī)格）中，16℃靜置培養(yǎng)36 h。最后按10%接種量（體積比）將二級(jí)種子液接入含有135 mL麥汁的250 mL三角瓶?jī)?nèi)，10℃靜置發(fā)酵7 d。發(fā)酵期間每12 h稱重一次，當(dāng)CO2失重量小于0.1 g時(shí)視為發(fā)酵終止。發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，檢測(cè)餾出酒樣的酒精度及風(fēng)味物質(zhì)含量。

1.2.4 基本發(fā)酵性能分析

采用稱重法測(cè)定CO2釋放量；采用斐林試劑法[15]測(cè)定發(fā)酵液中剩余還原糖含量；采用密度瓶法測(cè)定酒樣中的酒精度；采用次甲基藍(lán)染色法檢測(cè)酵母死亡率。

1.2.5 風(fēng)味物質(zhì)含量檢測(cè)

主要風(fēng)味物質(zhì)含量通過(guò)氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)[16]。氣相色譜儀的色譜柱采用Agilent HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），載氣為高純氮?dú)?，柱流速?.8 mL/min，進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度150℃。升溫程序：起始溫度50℃，保持8 min，以5℃/min升至150℃，保持15 min；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1。

1.2.6 生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)

利用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀檢測(cè)出發(fā)菌株與重組菌株的生長(zhǎng)曲線，具體操作參考葛峻伶等[17]的方法。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)均設(shè)置3組平行，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示。使用Student’s t-test檢驗(yàn)分析重組菌株和出發(fā)菌株之間的差異，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株的獲得

重組表達(dá)盒中包含BAT2基因的上游同源臂BA與下游同源臂BB，通過(guò)酵母同源重組機(jī)制，重組表達(dá)盒能夠整合至BAT2基因位點(diǎn)處，實(shí)現(xiàn)對(duì)BAT2基因的敲除和ATF1基因的過(guò)表達(dá)。根據(jù)敲除BAT2后的酵母基因組序列，設(shè)計(jì)上下游引物，以陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株S5的基因組為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。

圖1 重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的PCR驗(yàn)證Fig.1 The PCR verification of recombinant strains S5-T，S5-V，S5-A

由圖1可知，以重組菌株S5-T、S5-V、S5-A基因組為模板時(shí)，能夠擴(kuò)增出單一明亮的條帶，且長(zhǎng)度與預(yù)期一致；以出發(fā)菌株S5基因組為模板則無(wú)法擴(kuò)增出條帶。驗(yàn)證結(jié)果證明了重組盒已經(jīng)成功替代了BAT2基因，實(shí)現(xiàn)了BAT2基因的敲除與ATF1基因的過(guò)表達(dá)。

2.2 重組菌株生長(zhǎng)性能的比較

為了確定不同啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)ATF1基因?qū)甑纳L(zhǎng)性能是否存在影響，檢測(cè)了出發(fā)菌株S5及重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 出發(fā)菌株S5與重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of parental strain S5 and recombinant strain S5-T、S5-V、S5-A

由圖2可知，在0～1 h時(shí)，酵母處于停滯期，生長(zhǎng)速度較緩慢；2 h～10 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酵母大量增殖，菌體濃度明顯增加；10 h后，酵母處于穩(wěn)定期，酵母數(shù)量基本保持不變。3株重組菌株與出發(fā)菌株S5的生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異，這證明不同啟動(dòng)子對(duì)ATF1基因的過(guò)表達(dá)和BAT2基因的敲除對(duì)菌株的生長(zhǎng)性能沒(méi)有造成負(fù)面影響。

2.3 重組菌株基本發(fā)酵性能的比較

出發(fā)菌株S5與重組菌株S5-T、S5-V、S5-A發(fā)酵性能分析見(jiàn)表3，啤酒酵母菌株的CO2釋放量曲線見(jiàn)圖3。

表3 出發(fā)菌株S5與重組菌株S5-T、S5-V、S5-A發(fā)酵性能分析Table 3 The fermentation performances of strains S5，S5-T，S5-V，S5-A

圖3 啤酒酵母菌株的CO2釋放量曲線Fig.3 The CO2weight loss curve of brewer's yeast strain

在啤酒發(fā)酵過(guò)程中，剩余還原糖含量、細(xì)胞死亡率與發(fā)酵度是衡量酵母菌株基本發(fā)酵性能的幾種常規(guī)指標(biāo)。由表3可知，出發(fā)菌株S5發(fā)酵液的剩余還原糖含量為1.40 g/100 mL，死亡率為1.23%，外觀發(fā)酵度與真正發(fā)酵度分別為71.32%和61.53%。與出發(fā)菌株相比，重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的基本發(fā)酵性能均未見(jiàn)明顯差異。此外，通過(guò)發(fā)酵期間CO2的釋放量來(lái)檢測(cè)啤酒酵母菌株的發(fā)酵速率。由圖3可知，出發(fā)菌株S5與重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的CO2釋放量趨勢(shì)基本一致，發(fā)酵周期為7 d，總失重均為4.9 g。這些結(jié)果表明，利用啟動(dòng)子TEF1p、VPS8p、ATF1p過(guò)表達(dá)ATF1基因不會(huì)影響啤酒酵母菌株的基本發(fā)酵性能。

2.4 產(chǎn)酒精能力的測(cè)定

啤酒酵母菌株生成酒精的能力對(duì)啤酒的發(fā)酵有著重要的影響，采用密度瓶法檢測(cè)酒樣中的酒精度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 出發(fā)菌株與重組菌株的乙醇含量Table 4 The ethanol contents produced by parental strain and recombinant strains

由表4可知，菌株S5-T、S5-V和S5-A的酒精度分別為 3.75%vol、3.79%vol和 3.76%vol，與出發(fā)菌株S5的酒精度（3.8%vol）相比無(wú)明顯差別。在啤酒酵母的酯類物質(zhì)代謝中，雖然部分乙醇在醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶的催化下會(huì)被轉(zhuǎn)化為乙酸乙酯，但研究結(jié)果證明過(guò)表達(dá)ATF1基因不會(huì)對(duì)菌株的產(chǎn)酒精能力造成負(fù)面影響。在Zhang等[18]的研究中，利用磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子PGK1p過(guò)表達(dá)ATF1基因的菌株，其乙醇生成能力同樣未受到影響，這支持了本文的研究結(jié)果。

2.5 風(fēng)味物質(zhì)含量的測(cè)定

酵母菌株S5、S5-T、S5-V、S5-A經(jīng)過(guò)麥芽汁啤酒發(fā)酵后，利用氣相色譜檢測(cè)了主要風(fēng)味物質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的風(fēng)味物質(zhì)生成量Fig.4 The concentration of flavor substance produced by strain S5，S5-T，S5-V and S5-A

由圖4可知，菌株S5-T、S5-V、S5-A的乙酸乙酯生成量較出發(fā)菌株S5分別提高了2.56倍、1.21倍和1.24倍。高級(jí)醇類物質(zhì)中，異丁醇與異戊醇的含量出現(xiàn)了較為明顯的變化。與出發(fā)菌株S5相比，菌株S5-T、S5-V、S5-A的異丁醇生成量分別降低了12.17%、17.93%、16.85%；異戊醇生成量分別降低了10.2%、5.79%、8.21%；正丙醇含量沒(méi)有明顯變化。

結(jié)果表明，利用啟動(dòng)子TEF1p、VPS8p、ATF1p對(duì)ATF1基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)能夠小幅度調(diào)控乙酸乙酯的生成量。在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ATF1基因會(huì)提高醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶的酶活力，這是乙酸乙酯含量提高的主要原因[19-21]。Fischer等[22]利用啟動(dòng)子UBI4p過(guò)表達(dá)ATF1基因，冷激條件下乙酸乙酯含量較親本菌株增加1.3倍，這與本文的研究結(jié)果相似。另外，BAT2基因的缺失導(dǎo)致了支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的酶活力降低，阻礙了纈氨酸、亮氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮異戊酸和α-酮異己酸，這兩種α-酮酸合成受阻使異丁醇和異戊醇的生成量降低[23-24]。

2.6 重組菌株醇酯比的比較

乙酸乙酯是啤酒中含量最高的酯類物質(zhì)，因此用乙酸乙酯含量來(lái)代表總酯含量[3]。菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的醇酯比見(jiàn)圖5。

圖5 菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的醇酯比Fig.5 Ratio of higher alcohols to esters in strains S5，S5-T，S5-V and S5-A

由圖5可知，出發(fā)菌株S5的醇酯比為8.1∶1，遠(yuǎn)高于拉格啤酒的最適醇酯比[7]。由于菌株S5-T、S5-V、S5-A的總高級(jí)醇生成量下降，總酯生成量提高，因此醇酯比發(fā)生了變化。當(dāng)VPS8p和ATF1p調(diào)控ATF1基因時(shí)，菌株S5-V和S5-A的醇酯比略有下降，分別為6.2∶1和5.9∶1。菌株S5-T的醇酯比為2.9∶1，最接近最適醇酯比。結(jié)果證明利用TEF1p、VPS8p和ATF1p對(duì)ATF1基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)能夠有效地調(diào)控總高級(jí)醇和總酯的含量，優(yōu)化醇酯比，從而達(dá)到提高啤酒品質(zhì)的目的。

3 結(jié)論

以啤酒酵母S5為出發(fā)菌株，利用啟動(dòng)子TEF1p、VPS8p和ATF1p分別過(guò)表達(dá)ATF1基因，選育出重組菌株S5-T、S5-V和S5-A。通過(guò)啤酒發(fā)酵試驗(yàn)，探究了不同啟動(dòng)子元件對(duì)啤酒醇酯比的調(diào)控效果和影響。結(jié)果顯示，菌株S5-V和S5-A的醇酯比偏高，分別為6.2∶1和5.9∶1，這可能是由于VSP8p和ATF1p的啟動(dòng)子強(qiáng)度較低，導(dǎo)致乙酸乙酯含量提升幅度較低；菌株S5-T的醇酯比為2.9∶1，接近啤酒的醇酯比要求，具有一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。后續(xù)研究可以采用啟動(dòng)子工程，對(duì)啟動(dòng)子元件進(jìn)行改造，進(jìn)一步選育符合啤酒醇酯比要求的啤酒酵母菌株。本研究證實(shí)了利用不同啟動(dòng)子元件調(diào)控啤酒醇酯比的可行性，為選育具有優(yōu)良工業(yè)啤酒酵母菌種提供了新的改造策略和參考。