薏苡仁乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化及活性成分變化分析

吳映梅，徐龍泉，王瑤佳，周紹琴，周艷*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州中煙工業(yè)有限公司技術(shù)中心，貴州 貴陽 550000）

薏苡仁又稱薏米，為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁[1]，廣泛種植在我國各地，遼寧、福建、湖北為主產(chǎn)地[2]。薏苡仁富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、粗纖維、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)[3-4]，其營養(yǎng)價值較高[5]。研究表明，薏苡仁具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血壓、抗病毒等多方面生物活性[6]。因此，薏苡仁具有很高的開發(fā)利用價值。隨著人們生活質(zhì)量逐漸提高，對功能性食品的關(guān)注也逐漸增加。具有增強(qiáng)免疫力等生理功能的乳酸飲料成為研究熱點(diǎn)。

近年來，利用乳酸菌發(fā)酵制備飲料已在食品研究領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。乳酸菌發(fā)酵飲料是將原料嚴(yán)格消毒后，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后調(diào)制而成的產(chǎn)品[7]。乳酸菌呈革蘭氏陽性，具有無孢子、觸酶陰性、耐酸及兼性厭氧等特性，其最佳pH值在4.0～4.5[8]。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸能抑制有害微生物的生長繁殖、起到抑菌和抗感染作用[9]。此外，經(jīng)發(fā)酵后的乳酸菌飲料對降低膽固醇、促進(jìn)胃腸蠕動，提高鈣、磷的利用率也有較好的作用。乳酸菌發(fā)酵還有助于結(jié)合酚類物質(zhì)的釋放，產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)[10]。目前，研究報道使用的主要發(fā)酵菌種有雙歧桿菌（Bifidobacterium）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等。發(fā)酵的原料主要有糙米、蕎麥、大米、胡蘿卜、西藍(lán)花、黑木耳、石斛、山楂、紅豆、紫薯和玉米等原料或者采用兩種或兩種以上原料混合[11]。乳酸發(fā)酵是世界上具有較高經(jīng)濟(jì)價值的發(fā)酵方法[12]。薏苡仁乳酸菌發(fā)酵飲料是推出的一款新型功能飲料，其制作工藝復(fù)雜，與直接用原料烹飪的食物相比，發(fā)酵谷物食品通常更美味、更容易消化，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、有機(jī)酸和各種游離氨基酸等[13-14]。因此，發(fā)酵飲料的制作工藝尤為關(guān)鍵，工藝流程中的每個環(huán)節(jié)都極其重要，最優(yōu)的菌種發(fā)酵工藝成為飲料加工的重要保證[15]。

本試驗(yàn)以目前主要使用的菌種（植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）作為薏苡仁漿液的發(fā)酵菌種，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行探討。目前，薏苡仁中的活性成分在發(fā)酵過程中的變化研究較少，因此本試驗(yàn)選擇總酚和β-葡聚糖作為測定對象，探究其在乳酸菌發(fā)酵薏苡仁漿液發(fā)酵前后的變化規(guī)律，為薏苡仁發(fā)酵飲料的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏苡仁：市售；嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌：廣東省微生物菌種保藏中心；α-淀粉酶（3 700 U/g）：湖北常奧藥業(yè)有限公司；亞鐵氰化鉀、無水碳酸鈉、乙酸鋅、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、磷酸氫二鈉、沒食子酸、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、硫酸鉀、福林酚試劑（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：莫克化工技術(shù)有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：上海邁邦生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BOXUN高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHP-160恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；JINGHUA紫外分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；FA2004B pH計：上海雷磁廠家；TD5Z高速離心機(jī)：上海重逢科學(xué)儀器有限公司；YMC-306Q烤箱：廣州市番禺成功烘焙設(shè)備制造有限公司；HH-8恒溫水浴鍋：廣州市典銳化玻實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；IST-3075/4075（R）恒溫?fù)u床：上海沉匯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取1 200 g薏苡仁，經(jīng)烤箱（180℃、40 min）烘烤后取出，待薏苡仁冷卻后將其磨粉，過100目篩，裝袋并做好標(biāo)記，備用。

1.3.2 菌種活化

稱取MRS肉湯培養(yǎng)基49.3 g，加蒸餾水1 L，加熱煮沸直至完全溶解，高壓蒸汽滅菌（121℃、20 min），移取適量培養(yǎng)液放入保藏菌種的安瓿管中，使菌種充分溶解，在搖床中培養(yǎng)24 h。

1.3.3 薏苡仁樣液發(fā)酵

稱取40 g烘烤過的薏苡仁粉，按1∶6（g/mL）的料液比進(jìn)行調(diào)配，添加0.01%α-淀粉酶，在60℃水浴鍋中酶解10 min。將薏苡仁漿液在83℃下巴氏殺菌30 min。在無菌操作臺中將3種菌種分別接種（接種量3%）到薏苡仁漿液中，將其分別放入最適生長溫度（植物乳桿菌37℃、保加利亞乳桿菌42℃、嗜熱鏈球菌42℃）恒溫培養(yǎng)48 h，通過測定發(fā)酵液中的菌落總數(shù)、總酸、總還原糖及pH值，確定最優(yōu)菌種。

1.3.4 乳酸菌菌落總數(shù)的測定

利用生理鹽水將發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋至適宜濃度，采用MRS固體培養(yǎng)基平板計數(shù)，每種菌進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，單位CFU/mL。

1.3.5 總酸測定

參考GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測定》[16]中的方法進(jìn)行測定，總酸酸度以乳酸計。

1.3.6 還原糖測定

參考GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》[17]中的方法進(jìn)行測定。

1.3.7 pH值測定

薏苡仁發(fā)酵漿液樣品在設(shè)定條件下發(fā)酵結(jié)束，用pH計測出其對應(yīng)的值，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.8 感官評定

采用描述性檢驗(yàn)法[18]。評定小組由10名人員組成，對薏苡仁發(fā)酵漿液樣品的色澤、香味及組織形態(tài)進(jìn)行描述性評價，得出每個樣品的總分值，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 薏苡仁乳酸菌發(fā)酵漿液的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of lactic acid bacteria fermentation broth of Coix seed

1.3.9 薏苡仁發(fā)酵漿液工藝優(yōu)化

1.3.9.1 單因素試驗(yàn)

選取發(fā)酵時間（15、20、25、30、35 h）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵溫度（33、35、37、39、40 ℃）和料液比[1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7、1 ∶8、1 ∶9（g/mL）]作為考察因素，以pH值及感官評分為指標(biāo)，每個因素重復(fù)3次。

1.3.9.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時間、接種量、溫度以及料液比進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平如表2所示。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Level factors of L9（34）orthogonal test

1.3.10 薏苡仁發(fā)酵漿液中活性成分測定及分析

總酚采用福林酚法稍作修改進(jìn)行測定[19]。標(biāo)準(zhǔn)品的配制：準(zhǔn)確稱取0.1 g沒食子酸，用50 mL蒸餾水溶解、定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mL 于 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品處理：稱取2 g薏苡仁漿液，加入蒸餾水20 mL，溶解。以3 000 r/min離心10 min，取其上清液，稀釋50倍。取1 mL薏苡仁漿液于15 mL試管中，分別加入1 mL福林酚顯色劑及3 mL 20%碳酸鈉，混勻，于50℃水浴反應(yīng)30 min。在765 nm波長下測定吸光度。以總酚含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.004 8x（R2=0.996 1）。

β-葡聚糖采用剛果紅測定法測定[20]。以β-葡聚糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.402 6x（R2=0.992 5）。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，將試驗(yàn)測定的數(shù)據(jù)整理后，用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種選擇

2.1.1 薏苡仁發(fā)酵漿液中總酸含量的測定

薏苡仁發(fā)酵漿液中總酸含量的測定見圖1。

圖1 發(fā)酵液中總酸含量的測定Fig.1 Determination of total acid content in fermentation broth

由圖1可知，用植物乳桿菌發(fā)酵的薏苡仁漿液中總酸含量最高，為（5.94±0.06）g/100 g，而用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏苡仁漿液中總酸含量相對較少，分別為（3.60±0.40）g/100 g和（5.40±0.60）g/100 g，可推斷植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力高于嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。

2.1.2 薏苡仁發(fā)酵漿液中還原糖的測定

薏苡仁發(fā)酵漿液中還原糖含量的測定見圖2。

圖2 發(fā)酵漿液中還原糖含量的測定Fig.2 Determination of reducing sugar content in fermentation broth

由圖2可知，用保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏苡仁漿液中還原糖含量最高，為（0.55±0.45）g/100 g，其次為植物乳桿菌（0.51±0.49）g/100 g，最后為嗜熱鏈球菌（0.44±0.56）g/100 g。因此，可以推斷3種菌中消耗還原糖的能力由弱到強(qiáng)的順序依次為保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌。

2.1.3 薏苡仁發(fā)酵漿液中菌落總數(shù)的測定

薏苡仁發(fā)酵液中的菌落總數(shù)見表3。

表3 菌落總數(shù)的測定Table 3 Determination of total bacterial count

由表3可知，用植物乳桿菌發(fā)酵的薏苡仁漿液中菌落總數(shù)最多，達(dá)到了2.38×1011CFU/mL，而用嗜熱鏈球菌發(fā)酵的薏苡仁漿液中菌落總數(shù)只有1.80×105CFU/mL，保加利亞乳桿菌中的菌落總數(shù)為1.14×107CFU/mL。因此，可以推斷在相同的生長條件下，植物乳桿菌的繁殖能力較其它兩種乳酸菌強(qiáng)。

2.1.4 薏苡仁發(fā)酵漿液中pH值的測定

薏苡仁發(fā)酵液pH值的測定見圖3。

圖3 pH值的測定Fig.3 Determination of pH

由圖3可知，用嗜熱鏈球菌發(fā)酵的薏苡仁漿液中pH值最高，為4.62±0.38，而用植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏苡仁漿液pH值較低，分別為3.42±0.58和4.24±0.76，說明在相同條件下，嗜熱鏈球菌產(chǎn)生乳酸的能力最弱，其次為保加利亞乳桿菌，最后為植物乳桿菌。

綜上所述，用植物乳桿菌發(fā)酵的薏苡仁漿液中總酸含量較高、還原糖含量較低、pH值較低、菌落總數(shù)較多。因此，以總酸含量高、還原糖含量低、pH值低、菌落總數(shù)多為判定標(biāo)準(zhǔn)[21]篩選出最優(yōu)的發(fā)酵菌種為植物乳桿菌。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對發(fā)酵液的影響

料液比對發(fā)酵液的影響結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對發(fā)酵液的影響Fig.4 Effects of solid-to-liquid ratio on fermentation broth

由圖4可知，在5個梯度的料液比中，料液比為1 ∶8（g/mL）的感官評分最高，其中，料液比 1∶8（g/mL）和 1∶7（g/mL）pH 值較低，因此，當(dāng)料液比為 1∶8（g/mL）時，薏苡仁發(fā)酵漿液的感官效果最佳。

2.2.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵液的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵液的影響結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵時間對發(fā)酵液的影響Fig.5 Effects of fermentation time on fermentation broth

由圖5可知，發(fā)酵時間20 h時，感官評分最高，達(dá)到了（82.6±7.4）分。其中發(fā)酵時間15 h時，pH值最高，其余發(fā)酵時間下的pH值均較低。因此，當(dāng)發(fā)酵時間20 h時，薏苡仁發(fā)酵漿液的感官效果最佳。

2.2.3 接種量對發(fā)酵液的影響

接種量對發(fā)酵液的影響結(jié)果見圖6。

圖6 接種量對發(fā)酵液的影響Fig.6 Effects of inoculation amount on fermentation broth

由圖6可知，接種量為2%時感官評分最高，并且pH值也較低，因此，當(dāng)接種量為2%時，薏苡仁發(fā)酵漿液的感官效果最佳。

2.2.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液的影響

發(fā)酵溫度對發(fā)酵液的影響結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液的影響Fig.7 Effects of fermentation temperature on fermentation broth

由圖7可知，發(fā)酵溫度為35℃時，感官評分最高。發(fā)酵溫度35℃時，pH值最低。因此，當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時，薏苡仁發(fā)酵漿液的感官效果最佳。

綜上所述，當(dāng)料液比為1∶8（g/mL）、發(fā)酵時間為20 h、接種量為2%，發(fā)酵溫度為35℃時，感官評分較高，pH值相對較低，說明此時的薏苡仁發(fā)酵漿液香味適中，協(xié)調(diào)悅?cè)?，分層和沉淀較少，色調(diào)也較為協(xié)調(diào)。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以感官評分和pH值為指標(biāo)，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，對薏苡仁乳酸菌發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of fermentation condition optimization

由表4可知，影響順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間＞料液比，最佳方案為A1B1C3D3，即工藝為料液比1 ∶7（g/mL）、接種量 1%、發(fā)酵時間 25 h、發(fā)酵溫度37℃時最有利于發(fā)酵漿液的感官評分及酸的形成。在此條件下進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，對發(fā)酵制得的漿液進(jìn)行感官評定和理化分析，所得產(chǎn)品的感官評分為86分，pH值為5.01。

2.4 發(fā)酵前后活性成分分析

2.4.1 β-葡聚糖含量測定

薏苡仁漿液中β-葡聚糖在發(fā)酵后35 h內(nèi)的含量變化如圖8所示。

圖8 β-葡聚糖在不同發(fā)酵時間下的含量變化Fig.8 Changes of β-glucan content in different fermentation time

由圖8可知，乳酸發(fā)酵液中的β-葡聚糖含量有所增加，原因是發(fā)酵液中的乳酸水解了含β-糖苷鍵的寡糖[22]，從而導(dǎo)致β-葡聚糖含量偏低。但在發(fā)酵過程中發(fā)酵漿液中可能以葡萄糖為原料形成了一些β-葡聚糖物質(zhì)[23]，發(fā)酵后乳酸達(dá)到一定含量，β-糖苷鍵的寡糖不在或較少被乳酸水解[24]，因此導(dǎo)致β-葡聚糖的含量有所增加。薏苡仁發(fā)酵漿液中，β-葡聚糖含量在發(fā)酵 25 h時達(dá)到最高，為（0.56±0.44）g/mL。

2.4.2 總酚含量變化

薏苡仁漿液中總酚在發(fā)酵35 h內(nèi)含量變化如圖9所示。

圖9 總酚在不同發(fā)酵時間的含量測定Fig.9 Determination of total phenols in different fermentation time

由圖9可知，總酚含量隨著發(fā)酵時間延長呈先上升后平緩的趨勢，原因是在發(fā)酵前某些結(jié)合酚的羥基部分與某些醇類物質(zhì)相結(jié)合，總酚的含量較低[25]。另外，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了乳酸，部分酚類物質(zhì)被乳酸分解所致含量偏低。經(jīng)過植物乳桿菌發(fā)酵后，乳酸達(dá)到一定含量，酚類物質(zhì)不在或較少被乳酸分解，某些可溶性的結(jié)合酚被釋放，從而使總酚含量有所增加[26]。薏苡仁發(fā)酵漿液中，總酚含量在發(fā)酵25 h時達(dá)到最高，為169.10 mg/mL。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出最適宜發(fā)酵薏苡仁漿液的乳酸菌為植物乳桿菌，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，最終優(yōu)化了其發(fā)酵工藝，確定了發(fā)酵條件為料液比1∶7（g/mL）、接種量1%、發(fā)酵時間25 h、發(fā)酵溫度37℃，為后續(xù)制作乳酸菌發(fā)酵飲料提供參考。另外，測定了薏苡仁發(fā)酵液在不同發(fā)酵時間內(nèi)活性成分總酚和β-葡聚糖的含量變化，兩種活性成分均在發(fā)酵25 h時達(dá)到最高，分別為169.10 mg/mL和0.56 g/mL。因此，此試驗(yàn)篩選出的植物乳桿菌增加了原發(fā)酵漿液中的生理活性成分含量，提高其營養(yǎng)價值。