馬尾松葉片揮發(fā)物組成及其對(duì)松墨天牛有觸角電生理反應(yīng)的活性成分鑒定*

賴 略 鄒學(xué)冰 徐金柱 秦長生 楊 華 田龍艷 張春花 邱華龍

(1.河源市森林病蟲害防治服務(wù)中心，廣東 河源 517000; 2.河源市源城區(qū)林業(yè)綜合服務(wù)中心，廣東 河源517000；3.廣東省林業(yè)科學(xué)研究院/廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510520）

松墨天牛Monochamus alternatus是我國松林最為嚴(yán)重的一種病害松材線蟲病的主要傳播媒介之一[1]。松墨天牛在廣東主要危害馬尾松Pinus massoniana，同時(shí)也危害云南松P. yunnanensis、雪松Cedrus deodara以及黑松P. thunbergii等其它多種松科植物[2]。松墨天牛幼蟲可蛀食樹干韌皮部及木質(zhì)部，阻斷和破壞輸導(dǎo)組織，影響植物生長所需的水分和養(yǎng)分運(yùn)輸，嚴(yán)重阻礙樹木生長。此外，松墨天牛成蟲羽化后補(bǔ)充營養(yǎng)階段造成的植物傷口促使松材線蟲傳入健康松樹，從而引發(fā)松材線蟲病，使松樹發(fā)病繼而枯死[3-4]。松墨天牛成蟲傳播的松材線蟲病是我國重大的林業(yè)植物疫情之一，它能在較短時(shí)間內(nèi)引發(fā)大面積松林感病和死亡，對(duì)我國廣大松林資源構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

對(duì)于松材線蟲病的防治，目前主要依靠人工方法及時(shí)清理病枯死松樹，并在松墨天牛羽化盛期噴灑噻蟲啉等藥劑防治這種媒介昆蟲[5-7]。這些防治方法需要投入巨大的人力、物力和財(cái)力，雖然能暫時(shí)阻止松墨天牛的快速擴(kuò)散蔓延，但是不能有效對(duì)松材線蟲進(jìn)行長期的可持續(xù)控制。一旦財(cái)政經(jīng)費(fèi)投入減少，松材線蟲病又很快死灰復(fù)燃，不斷擴(kuò)散蔓延。因此，亟需探索研究其它防治方法對(duì)其進(jìn)行可持續(xù)性控制。

天牛主要利用觸角通過寄主植物釋放的揮發(fā)物進(jìn)行遠(yuǎn)距離定位寄主植物，然后通過聚集信息素尋找配偶并進(jìn)行交配繁殖[8-9]。根據(jù)松墨天牛聚集信息素主要成分開發(fā)的松墨天牛引誘劑已在全國松墨天牛監(jiān)測(cè)和防治中得到廣泛應(yīng)用。聚集信息素引誘劑中加入寄主植物信息素對(duì)天牛具有引誘活性的揮發(fā)物能夠擴(kuò)大對(duì)天牛的作用距離，從而提高引誘劑的引誘效果[8]。雖然利用松墨天牛聚集信息素十一烷氧基乙醇誘殺松墨天牛已得到廣泛應(yīng)用[10]，但是目前馬尾松揮發(fā)物中對(duì)松墨天牛具有生理活性的成份尚不清楚，而且無添加到引誘劑配方中的報(bào)道。因此，本研究將分析鑒定馬尾松葉片揮發(fā)物成份，并測(cè)試揮發(fā)物成份對(duì)松墨天牛雌雄成蟲的觸角電生理反應(yīng)，以期為增強(qiáng)現(xiàn)有松墨天牛誘芯的引誘活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 松墨天牛采集與飼養(yǎng)

2021年4-10月在廣東省河源市源城區(qū)松林內(nèi)通過掛放松墨天牛誘捕器進(jìn)行誘集成蟲，每天下午16：00時(shí)將誘集罐中的天牛放入養(yǎng)蟲籠中帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度 (45 ± 5 )%、光周期L : D=12 h : 12 h。每天用新鮮的馬尾松枝條飼喂。

1.2 松墨天牛對(duì)馬尾松植物的偏好選擇

使用自制的Y型嗅覺儀（主臂長30 cm、分支臂長25 cm、兩分支臂角度120。，內(nèi)徑5 cm）測(cè)定松墨天牛對(duì)寄主植物馬尾松的選擇行為。將氣泵進(jìn)氣口通過橡膠軟管連接一根活性炭過濾管（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm），吸附空氣中的雜質(zhì)。氣泵出氣口通過聚四氟乙烯管連接裝有超純水的洗氣瓶，對(duì)泵入的空氣進(jìn)行濕潤。然后再用聚四氟乙烯管連接至裝有寄主植物的氣味瓶，隨后氣味瓶再分別連接Y型嗅覺儀的兩臂。在Y型嗅覺儀的柄端放入松墨天牛，觀察并記錄松墨天牛對(duì)寄主植物氣味的選擇行為。選擇標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)試蟲沿著柄端爬行到兩臂交接處，然后選擇一臂超過臂長的1/2并且停留時(shí)間超過1 min，即判定為對(duì)該臂連接的寄主植物做出偏好選擇；如果試蟲停留在嗅覺儀柄端處超10 min，但仍沒做出選擇，則確定其為無反應(yīng)。每15頭蟲作為一組，測(cè)定一組試蟲后用丙酮和蒸餾水沖洗后擦干，繼續(xù)測(cè)定，總共測(cè)定4組。

1.3 馬尾松葉片揮發(fā)物的提取與鑒定

將干凈的馬尾松嫩葉葉片30 g放在正己烷（HPLC純）中，浸泡20 min以收集葉片的揮發(fā)性物質(zhì)，用無水Na2SO4除去樣品中的水分，用帶過濾尼龍膜的一次性移液針將液體樣品轉(zhuǎn)移到2 mL的棕色樣品瓶內(nèi)，并用氮吹儀中的高純氮?dú)鈱悠窛饪s至200 μL, 保存在-20 ℃冰箱內(nèi)待用。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS：安捷倫7890B-5977B）對(duì)樣品化合物進(jìn)行分析鑒定。

使用的氣相色譜儀為安捷倫7890B，色譜柱型號(hào)為HP-5ms毛細(xì)管色譜柱，色譜柱長度*內(nèi)徑*膜厚= 0.25 mm*30 m*0.25 μm。 色譜柱柱流量為1mL/min，載氣為99.999%高純氮?dú)狻＿M(jìn)樣口溫度為220 ℃，不分流進(jìn)樣。柱箱程序升溫程序?yàn)椋?0 ℃保留 2 min，然后以15 ℃/min升至235 ℃。后運(yùn)行溫度為270 ℃，時(shí)間為6 min。

質(zhì)譜條件為：傳輸線溫度280℃，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲4 min，離子掃描范圍50-500 m/z。使用C7-C40的正構(gòu)烷烴混合物標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算目標(biāo)化合物的相對(duì)保留指數(shù)(Retension Index, RI)，RI的計(jì)算公式參照文獻(xiàn)中的公式計(jì)算[11]。同時(shí)根據(jù)NIST17譜庫中的特征離子碎片信息及化合物的保留指數(shù)對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。選取Masshunter軟件中NIST17普庫比對(duì)中匹配值最大的化合物（匹配值需大于等于85%）為鑒定化合物，當(dāng)最大匹配度＜85%時(shí)，將該化合物定性為未知化合物。對(duì)峰面積＞最大峰面積的1%的目標(biāo)峰進(jìn)行積分，并計(jì)算其相對(duì)百分含量。

1.4 松墨天牛對(duì)馬尾松松揮發(fā)物的觸角電生理反應(yīng)

用氣象色譜-觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD)測(cè)試松墨天牛雌、雄成蟲對(duì)寄主植物揮發(fā)物的觸角電生理反應(yīng)。氣象色譜端的條件與上述GC-MS中的相同。利用EAG昆蟲觸角電位記錄儀（荷蘭Syntech公司）測(cè)定揮發(fā)物引起昆蟲的觸角電生理反應(yīng)大小。首先沿松墨天牛觸角基部將觸角剪下約2 cm，并在觸角尖部用小刀將表皮切開約0.5 mm的細(xì)口，然后將處理好的觸角連接到觸角電位儀的兩個(gè)玻璃電極上。手動(dòng)進(jìn)樣2 μL，不分流進(jìn)樣。GC和EAD分流平板的樣品分流比為1 : 1，測(cè)試松墨天牛雌雄成蟲對(duì)寄主植物氣味的電生理反應(yīng)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)6根觸角以上，當(dāng)對(duì)松墨天牛重復(fù)3次以上都有反應(yīng)的化合物質(zhì)則為活性化合物。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件中非參數(shù)檢驗(yàn)的卡方對(duì)選擇寄主植物的松墨天牛數(shù)量進(jìn)行差異顯著性分析（P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 松墨天牛對(duì)寄主植物氣味的行為選擇

松墨天牛對(duì)寄主植物氣味與空白對(duì)照的選擇結(jié)果表明（圖1），78.33%的天牛選擇寄主植物氣味（c2=27.65，df = 1，P＜ 0.001），說明馬尾松葉片氣味對(duì)松墨天牛均具有顯著的吸引作用。

圖1 松墨天牛對(duì)馬尾松寄主氣味的行為選擇Fig.1 Odor preferecne of Monochamus alternatus adults to volatiles of Pinus massoniana plant leaves

2.2 馬尾松葉片揮發(fā)物鑒定

通過GC-MS以及NIST17譜庫檢索分析馬尾松葉片中總共檢測(cè)到22種揮發(fā)性化合物（圖2、表1）其中萜烯類物質(zhì)14種，醇類物質(zhì)5種，羧酸類物質(zhì)和酯類物質(zhì)各1種，有1個(gè)未鑒定化合物。在上述揮發(fā)物中，相對(duì)含量超過8%的均為萜烯類化合物，其中β-蒎烯的相對(duì)百分含量最高，達(dá)（28.68±0.67.0）%，其次為α-蒎烯，含量達(dá)（21.03±5.08）%，然后依次為D-吉瑪烯（13.60±1.60）%、β-水芹烯（8.85±0.97）%以及β-石竹烯（8.24±5.08）%。

表1 馬尾松葉片揮發(fā)物組分及相對(duì)含量Table1 Chemicals and relative contents of volatiles from Pinus massoniana leaves

圖2 馬尾松葉片揮發(fā)物的TIC總離子流Fig.2 Total Ion chromatogram of volatiles of Pinus massoniana leaves

2.3 馬尾松葉片對(duì)松墨天牛的觸角電位反應(yīng)

GC-EAD檢測(cè)結(jié)果表明（圖3），馬尾松葉片揮發(fā)物中有6種化合物能夠引起松墨 天牛雌、雄成蟲的觸角電生理反應(yīng)。通過保留指數(shù)和GC-MS NIST譜庫鑒定比較，確定這6種物質(zhì)中5種為萜類化合物，分別為α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、β-石竹烯和D-吉瑪烯，1種為酯類物質(zhì)乙酸龍腦酯。松墨天牛雌雄成蟲之間對(duì)馬尾松揮發(fā)物有觸角電位反應(yīng)的揮發(fā)物種類沒有差別。

圖3 松墨天牛雌、雄成蟲對(duì)馬尾松葉片揮發(fā)物的觸角電生理反應(yīng)Fig. 3 Electroantennogram of antennae of female and male Monochamus alternatus adults to volatiles of Pinus massoniana leaves

3 討論

目前生產(chǎn)上對(duì)松材線蟲病的防治措施主要包括清理病枯死松樹、噴灑化學(xué)農(nóng)藥防治媒介昆蟲松墨天牛，以及利用誘捕器誘殺松墨天牛[6]。噴灑化學(xué)農(nóng)藥嚴(yán)重污染林業(yè)生態(tài)環(huán)境，人工清理病枯死樹需耗費(fèi)大量人力和物力，因此這些防治方法均存在較大弊端。誘捕器誘殺天牛是一種較為環(huán)保的監(jiān)測(cè)和控制松墨天牛種群密度的方法。然而，以松墨天牛的聚集信息素十一烷氧基乙醇為主要成分的誘芯制作的誘捕器的誘殺距離較短，對(duì)于長距離誘殺仍然是其短板。寄主植物揮發(fā)物在天牛遠(yuǎn)距離識(shí)別尋找寄主及產(chǎn)卵場(chǎng)所等行為過程中起關(guān)鍵作用[12-14]。研究松墨天牛對(duì)寄主植物揮發(fā)物的偏好行為及觸角電生理反應(yīng)，不僅對(duì)于松墨天牛有引誘活性的揮發(fā)物篩選有幫助，而且對(duì)提高現(xiàn)有誘捕器的引誘范圍和效果具有潛在作用。

Y型嗅覺儀選擇性試驗(yàn)表明，78.33%的松墨天牛選擇具有馬尾松氣味的一端，說明馬尾松葉片揮發(fā)物對(duì)松墨天牛的偏好選擇行為具有調(diào)控作用。馬尾松揮發(fā)物中主要為一些烯烴類的化合物，主要包括β-蒎烯、α-蒎烯、D-吉瑪烯、β-水芹烯以及β-石竹烯。這些綠葉揮發(fā)性氣味組成與現(xiàn)有報(bào)道較一致[15-16]。含量較多的上述5種化合物均可和引起松墨天牛雌雄成蟲明顯的觸角電生理反應(yīng)。寧眺等[17]對(duì)5種不同生理狀態(tài)(健康、人為物理損傷、餌木、取食和產(chǎn)卵)的馬尾松的萜烯化合物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不同生理狀態(tài)下萜烯化合物的相對(duì)含量會(huì)發(fā)生顯著變化，如隨著餌木的衰弱進(jìn)程，α-蒎烯的相對(duì)含量顯著減少而β-蒎烯的含量顯著增加，兩者比例的變化可能是馬尾松寄主樹勢(shì)衰弱程度變化的一個(gè)重要信號(hào)。此外，乙酸龍腦酯天然存在于冷杉Abies fabri油以及一些松科植物揮發(fā)性油中，在馬尾松葉片中的相對(duì)百分含量為（2.47±0.46）%，但是乙酸龍腦酯也可引起松墨天牛的觸角反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)馬尾松植物中存在α-畢橙茄醇兩種異構(gòu)體，但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，未能對(duì)這兩個(gè)異構(gòu)體進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別。

通常萜烯類化合物是植物綠葉中產(chǎn)生芳香氣味的主要物質(zhì)，對(duì)植物害蟲及其天敵的行為具有非常重要的調(diào)節(jié)作用[16,18]。α-蒎烯和β-蒎烯廣泛存在于松樹和杉木中，進(jìn)一步開展室內(nèi)及田間引誘試驗(yàn)對(duì)篩選松墨天牛誘芯增效劑，提高現(xiàn)有誘芯的引誘效率有積極作用。