卵泡抑素相關(guān)基因3 對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在乳腺癌增殖、遷移和侵襲中的機(jī)制研究

呂凌云，彭宇，魯亞琴，房賀，陳艷，姜玉，汪志平

世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）發(fā)布的2020 年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌是目前全球新增發(fā)病人數(shù)最多的癌癥［1］。在女性人群中，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。控制乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，成為防治乳腺癌亟待解決的問題。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是來源于外周血和組織中的巨噬細(xì)胞，占腫瘤質(zhì)量的50%［2］。乳腺癌患者體內(nèi)TAMs的積累通常與預(yù)后不良、治療耐藥和疾病復(fù)發(fā)有關(guān)［3］。TAMs 是連接炎癥和腫瘤的關(guān)鍵細(xì)胞，可通過釋放多種細(xì)胞因子和基質(zhì)蛋白酶直接促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，或通過介導(dǎo)腫瘤血管生成和免疫抑制間接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［4］。TAMs 已成為癌癥治療的重要靶點(diǎn)。

卵泡抑素相關(guān)基因3（follistatin-related gene 3，F(xiàn)STL3）是一種致癌基因，編碼分泌型糖蛋白，與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。臨床乳腺癌患者的腫瘤上皮細(xì)胞中具有FSTL3 高表達(dá)，提示FSTL3 可能參與調(diào)控乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，并可作為乳腺癌診斷的潛在血漿標(biāo)志物［6］。最近有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL3可通過調(diào)控骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號(hào)通路，促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞極化，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［7］。但FSLT3 是否能夠直接調(diào)控巨噬細(xì)胞的促腫瘤功能，還不清楚。本研究旨在評(píng)估FSTL3 在乳腺癌患者TAMs 中的表達(dá)，并探索FSTL3 是否可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展,為將來研究乳腺癌的致病機(jī)制和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 收集2018 年3 月至2021 年3 月在海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受切除手術(shù)的21 例乳腺癌患者的腫瘤及其癌旁組織（距腫瘤邊緣≥3 mm）。所有患者均是原發(fā)病例，手術(shù)前未接受放療和化療。該研究方案在海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的監(jiān)督下獲得批準(zhǔn)和實(shí)施（CHEC2017-096），患者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要材料 人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1 和人乳腺癌細(xì)胞株MCF7 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM 和RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Giboco 公司，干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、TRIzol 試劑和LipofectamineTM3000 購(gòu)自Invitrogen 公司，RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 試劑購(gòu)自上海翌圣公司，Percoll 分離液、基質(zhì)膠、佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）購(gòu)自Sigma公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK8 試劑購(gòu)自南京諾維贊公司，Transwell 小室購(gòu)自康寧公司，CD14 抗體、CD86 抗體、CD206 抗體購(gòu)自BD 公司，F(xiàn)STL3 抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自Proteintech 公司，F(xiàn)STL3 和GAPDH 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，si-FSTL3 和si-陰性對(duì)照（si-Negative Control，NC）通過Merck 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF7 和THP-1 在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。DMEM 和RPMI1640 培養(yǎng)基中含0.1 mg/ml 鏈霉素、青霉素和10%FBS。MCF7 使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，THP-1 使用RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞在其達(dá)到70%～90%密度，進(jìn)行細(xì)胞傳代或?qū)嶒?yàn)。

1.2.2 原代巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 將收集的乳腺癌腫瘤及其癌旁組織轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，使用PBS浸泡并洗滌3 次。將組織剪成細(xì)小碎塊，加入2 mg/ml的Ⅳ型膠原蛋白酶和0.25 mg/ml 透明質(zhì)酸酶重懸組織，并轉(zhuǎn)移至離心管。37 ℃，180 r/min 恒溫消化2 h，每30 min 吹打1 次。消化所得細(xì)胞懸液過40 μm 篩網(wǎng)，收集濾過夜，2 000 r/min 離心5 min。使用PBS 重懸細(xì)胞，利用percoll 法分離巨噬細(xì)胞。吸取中間白色層巨噬細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 PMA/IFN-γ 和PMA/IL-4 誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞將THP-1 細(xì)胞按3×105個(gè)/ml 數(shù)量鋪至6 孔板內(nèi)。加入含終濃度50 ng/ml PMA 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h后，獲得初始巨噬細(xì)胞。棄培養(yǎng)液，PBS 清洗細(xì)胞。分別加入含終濃度20 ng/ml IFN-γ 和20 ng/ml IL-4的培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h，使細(xì)胞分化為M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞。

1.2.4 siRNA 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將THP-1 按3×105個(gè)/ml數(shù)量接種至6 孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑說明將si-FSTL3和si-NC 轉(zhuǎn)染至THP-1 中。更換新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)2 d，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 THP-1 細(xì)胞分組以及THP-1 和MCF7 細(xì)胞共孵育 將THP-1 細(xì)胞分為5 組：使用PMA、PMA/IFN-γ 和PMA/IL-4 誘導(dǎo)THP-1 為初始、M1 型和M2型巨噬細(xì)胞，分別為PMA 組、PMA/IFN-γ 組、PMA/IL-4 組；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-FSTL3、si-NC 轉(zhuǎn)染至THP-1，再使用PMA/IL-4 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的THP-1，分別為si-FSTL3 組、si-NC 組。

將MCF7 按3×105個(gè)/ml 接種至6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入各組巨噬細(xì)胞上清繼續(xù)孵育12 h。孵育后的MCF7細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞分型 收集各組巨噬細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞2 次。隨后利用不同熒光標(biāo)記的CD14 抗體、CD86 抗體、CD206 抗體在4℃孵育40 min，染色后細(xì)胞重懸在流式細(xì)胞分析染色液（flow cytometry staining，F(xiàn)CS）buffer 中進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。使用FlowJo 10.0 軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析，用前向角散射（forward scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向角散色（side scatter，SSC）設(shè)門圈出活細(xì)胞群，通過CD14 設(shè)門圈出巨噬細(xì)胞群；通過CD86 設(shè)門圈出M1 型巨噬細(xì)胞；通過CD206 設(shè)門圈出M2 型巨噬細(xì)胞。

1.2.7 CCK8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞按5×104個(gè)/ml 數(shù)量接種于96 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁后。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h。根據(jù)CCK8 檢測(cè)試劑說明進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)下的吸光值。

1.2.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在小室（transwell）中鋪上基質(zhì)膠，小室浸沒在含DMEM 培養(yǎng)基的24 孔板中。將各組MCF7 按3×105個(gè)/ml 數(shù)量接種至小室中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室置于室溫，使用4% 的多聚甲醛固定20 min，再用0.1% 結(jié)晶紫染色20 min，最后用PBS 洗滌2 次后在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，隨機(jī)取10 個(gè)視野，取平均數(shù)，每組重復(fù)6 次。

1.2.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將MCF7 按3×105個(gè)/ml 數(shù)量接種至6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁后。用槍頭尖端在各組細(xì)胞上進(jìn)行垂直劃痕。使用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，在顯微鏡下拍照記錄。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后再次拍照記錄，通過Image J 軟件進(jìn)行距離測(cè)量，每組重復(fù)6 次。

1.2.10 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法 按照RNA 提取試劑說明書方法提取各組細(xì)胞RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后使用SYBR Green 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qualitative real time polymerase chain reation，qRTPCR)。FSTL3 上游引物：5’-GTGCCTCCGGCAACATTGA-3’下 游 引 物：5’-GCACGAATCTTTGCAGGGA-3'；GAPDH 上游引物：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物：5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃20 s，60℃1 min；72℃延伸5 min，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCT法計(jì)算FSTL3 的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.11 Western blotting 法 在各組細(xì)胞中加入RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞，離心收集上清液。通過BCA 法測(cè)定上清液的蛋白濃度，按30 μg/孔進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。隨后依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、抗原封閉、一抗孵育（4℃，12 h）。第2 天加入熒光二抗孵育，最后加入曝光液在凝膠成像儀下拍照。一抗稀釋比例：FSTL3（1∶1 000）、GAPDH（1∶3 000）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間單因素比較使用Student’st檢驗(yàn)分析，雙因素比較使用two-way ANOVA 分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌TAMs 分型和FSTL3 表達(dá)量檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌腫瘤及其癌旁組織中巨噬細(xì)胞分型，結(jié)果顯示腫瘤組織中CD206 陽性的巨噬細(xì)胞比例高于癌旁組織，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而CD86 陽性的巨噬細(xì)胞比例與癌旁組織相比無明顯差異。見表1。說明乳腺癌TAMs 呈M2 型極化。qRT-PCR 結(jié)果顯示腫瘤組織中TAMs 的FSTL3 mRNA 表達(dá)水平高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明乳腺癌TAMs 高表達(dá)FSTL3。見表2。

表1 乳腺癌及其癌旁組織中TAMs 分型檢測(cè)（%，±s，平行樣例數(shù)n=3）

表1 乳腺癌及其癌旁組織中TAMs 分型檢測(cè)（%，±s，平行樣例數(shù)n=3）

注：與癌旁組織比較aP<0.001

組織腫瘤組織癌旁組織CD206 55.35±2.32a 15.23±1.25 CD86 12.72±0.23 14.36±0.57

表2 乳腺癌及其癌旁組織中FSTL3 的mRNA 水平（± s，平行樣例數(shù)n=3）

表2 乳腺癌及其癌旁組織中FSTL3 的mRNA 水平（± s，平行樣例數(shù)n=3）

注：與癌旁組織比較aP<0.001；FSTL3 為卵泡抑素相關(guān)基因3

FSTL3 mRNA 12.32±0.97a 1.01±0.21組織腫瘤組織癌旁組織

2.2 PMA/IFN-γ 和PMA/IL-4 誘導(dǎo)THP-1 分型鑒定和FSTL3 表達(dá)量檢測(cè)

對(duì)PMA、PMA/IFN-γ 和PMA/IL-4 誘導(dǎo)后的THP-1 巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分型鑒定，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與PMA 組相比，PMA/IFN-γ 組CD86 陽性細(xì)胞的比例增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與PMA 組相比，PMA/IL-4 組CD206 陽性細(xì)胞的比例增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表3。說明PMA/IFN-γ 和PMA/IL-4 分別誘導(dǎo)THP-1 為M1 和M2 型巨噬細(xì)胞成功。qRT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示與PMA 組相比，PMA/IL-4 組細(xì)胞FSTL3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），而PMA 組和PMA/IFN-γ 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4、圖1。說明PMA/IL-4 誘導(dǎo)后的M2 型THP-1 巨噬細(xì)胞FSTL3 表達(dá)水平增加，與乳腺癌TAMs 表型更為接近，因此選擇此組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

表4 M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞中FSTL3 的mRNA 和蛋白水平（± s，平行樣例數(shù)n=3）

表4 M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞中FSTL3 的mRNA 和蛋白水平（± s，平行樣例數(shù)n=3）

注：與PMA 組比較aP<0.001；IFN-γ 為干擾素-γ，IL-4 為白細(xì)胞介素-4，PMA 為佛波酯，F(xiàn)STL3 為卵泡抑素相關(guān)基因3，GAPDH 為3-磷酸甘油醛脫氫酶

FSTL3 蛋白0.24±0.11 0.38±0.13 1.21±0.12a組別PMA 組PMA/IFN-γ 組PMA/IL-4 組FSTL3 mRNA 1.00±0.24 0.92±0.26 6.35±0.87a

圖1 M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞中FSTL3 蛋白水平檢測(cè)

表3 誘導(dǎo)THP-1 為M1 及M2 型巨噬細(xì)胞鑒定（%，± s，平行樣例數(shù)n=3）

表3 誘導(dǎo)THP-1 為M1 及M2 型巨噬細(xì)胞鑒定（%，± s，平行樣例數(shù)n=3）

注：與PMA 組比較aP<0.001；IFN-γ 為干擾素-γ，IL-4 為白細(xì)胞介素-4，PMA 為佛波酯

CD206 8.34±2.12 8.25±2.32 89.92±3.39a組別PMA 組PMA/IFN-γ 組PMA/IL-4 組CD86 7.24±1.28 87.12±4.25a 9.74±1.74

2.3 TAMs 促進(jìn)MCF7 細(xì)胞增殖

收集PMA 和PMA/IL-4 誘導(dǎo)后的THP-1 巨噬細(xì)胞上清與MCF7 細(xì)胞共孵育，采用CCK8 檢測(cè)MCF7 細(xì)胞24、48、72 h 的增殖情況。結(jié)果顯示與PMA 組相比，PMA/IL-4 組細(xì)胞的增殖能力增加，在72 h 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表5。說明TAMs 上清能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。

表5 M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)MCF7 細(xì)胞增殖能力的影響（± s，平行樣例數(shù)n=3）

表5 M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)MCF7 細(xì)胞增殖能力的影響（± s，平行樣例數(shù)n=3）

注：與PMA 組比較aP＜0.01；IL-4 為白細(xì)胞介素-4，PMA 為佛波酯

72 h 0.74±0.04 0.97±0.12a組別PMA 組PMA/IL-4 組24 h 0.28±0.03 0.28±0.02 48 h 0.45±0.02 0.47±0.02

2.4 TAMs 促進(jìn)MCF7 細(xì)胞遷移和侵襲

收集PMA 和PMA/IL-4 誘導(dǎo)后的THP-1 巨噬細(xì)胞上清與MCF7 細(xì)胞共孵育，通過Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)MCF7 細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示與PMA 組相比，PMA/IL-4 組細(xì)胞侵襲能力增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見圖2A、表6。采用細(xì)胞劃痕檢測(cè)對(duì)MCF7 細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示與PMA 組相比，PMA/IL-4 組細(xì)胞24 h 內(nèi)相對(duì)遷移能力增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見圖2B、表6。說明TAMs 上清能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。

圖2 M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)MCF7 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

表6 M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)MCF7 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響（± s，平行樣例數(shù)n=6）

表6 M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)MCF7 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響（± s，平行樣例數(shù)n=6）

注：與PMA 組比較aP＜0.01；IL-4 為白細(xì)胞介素-4，PMA 為佛波酯

組別PMA 組PMA/IL-4 組相對(duì)遷移率（%）16.32±0.77 24.24±2.16a侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）143±6 248±8a

2.5 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 極化影響

使用si-NC 和si-FSTL3 分別轉(zhuǎn)染THP-1 細(xì)胞后，再使用PMA/IL-4 進(jìn)行誘導(dǎo)，通過qRT-PCR 和Western blotting 檢測(cè)FSTL3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示與si-NC 組相比，si-FSTL3 組細(xì)胞FSTL3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3、表7。說明沉默F(xiàn)STL3 有效拮抗PMA/IL-4 誘導(dǎo)的TAMs FSTL3 表達(dá)水平增加。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si-NC 組和si-FSTL3 組巨噬細(xì)胞分型，結(jié)果顯示與si-NC 組相比，si-FSTL3 組CD206 陽性細(xì)胞的比例減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），而2 組間CD86 陽性細(xì)胞的比例無明顯差異。見表8。說明沉默F(xiàn)STL3 有效拮抗PMA/IL-4 誘導(dǎo)THP-1 向M2 型TAMs 極化。

圖3 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 中FSTL3蛋白表達(dá)水平的影響

表7 沉默F(xiàn)STL3 的mRNA 和蛋白表達(dá)（± s，平行樣例數(shù)n=3）

表7 沉默F(xiàn)STL3 的mRNA 和蛋白表達(dá)（± s，平行樣例數(shù)n=3）

注：與si-NC 組相比aP<0.01；FSTL3 為卵泡抑素相關(guān)基因3，GAPDH 為3-磷酸甘油醛脫氫酶

FSTL3 蛋白0.43±0.08 0.22±0.07a組別si-NC 組si-FSTL3 組FSTL3 mRNA 1.00±0.12 0.26±0.04a

表8 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 極化影響（%，± s，平行樣例數(shù)n=3）

表8 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 極化影響（%，± s，平行樣例數(shù)n=3）

注：與si-NC 組相比aP<0.001；FSTL3 為卵泡抑素相關(guān)基因3，TAMs 為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

CD206 87.13±2.63 43.21±3.63a組別si-NC 組si-FSTL3 組CD86 8.93±1.36 8.34±1.73

2.6 沉默F(xiàn)STL3 拮抗TAMs 對(duì)MCF7 細(xì)胞的促增殖作用

收集si-NC 組和si-FSTL3 組上清與MCF7 細(xì)胞共孵育，采用CCK8 檢測(cè)MCF7 細(xì)胞24、48、72 h 的增殖情況。結(jié)果顯示與si-NC 組相比，si-FSTL3 組細(xì)胞的增殖能力減弱，在72 h 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表9。說明沉默F(xiàn)STL3 有效拮抗TAMs 促進(jìn)MCF7 細(xì)胞增殖的能力。

表9 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 促M(fèi)CF7 細(xì)胞增殖作用中的影響（± s，平行樣例數(shù)n=3）

表9 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 促M(fèi)CF7 細(xì)胞增殖作用中的影響（± s，平行樣例數(shù)n=3）

注：與si-NC 組相比aP＜0.05；IL-4 為白細(xì)胞介素-4，PMA 為佛波酯，F(xiàn)STL3 為卵泡抑素相關(guān)基因3

72 h組別24 h 48 h 0.82±0.09 0.63±0.08a PMA 組PMA/IL-4 組0.29±0.01 0.29±0.04 0.52±0.02 0.46±0.02

2.7 沉默F(xiàn)STL3 拮抗TAMs 對(duì)MCF7 細(xì)胞的促遷移和侵襲作用

收集si-NC 組和si-FSTL3 組上清與MCF7 細(xì)胞共孵育，通過Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)MCF7 細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示與si-NC 組相比，si-FSTL3組細(xì)胞侵襲數(shù)量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4A、表10。采用細(xì)胞劃痕檢測(cè)對(duì)MCF7 細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示與si-NC 組相比，si-FSTL3 組細(xì)胞24 h 內(nèi)相對(duì)遷移能力減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4B、表10。說明沉默F(xiàn)STL3 有效拮抗TAMs 促進(jìn)MCF7 細(xì)胞遷移和侵襲的能力。

圖4 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 促進(jìn)MCF7 細(xì)胞侵襲和遷移的影響

表10 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 促進(jìn)MCF7 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響（± s，平行樣例數(shù)n=6）

表10 沉默F(xiàn)STL3 對(duì)TAMs 促進(jìn)MCF7 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響（± s，平行樣例數(shù)n=6）

注：與si-NC 組比較aP＜0.05；FSTL3 為卵泡抑素相關(guān)基因3，TAMs 為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

相對(duì)遷移率（%）20.15±1.38 12.63±0.43a組別si-NC 組si-FSTL3 組侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）145±5 109±7a

3 討論

乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，由于其高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，導(dǎo)致其死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［8］。目前的乳腺癌治療是以手術(shù)治療為主，再輔以放療、化療內(nèi)分泌治療、靶向治療等綜合治療，但乳腺癌的存活率因分期不同仍有很大差異［9］。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與長(zhǎng)期的慢性炎癥有關(guān)，炎癥下巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，分化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞M1 型和替代活化巨噬細(xì)胞M2 型［10］。Sousa 等［11］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的腫瘤微環(huán)境中，乳腺癌細(xì)胞分泌因子調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2 型分化。Li 等［12］發(fā)現(xiàn)，通過抑制TAMs 的數(shù)量來重塑免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（tumor microenvirmment，TME），能夠抑制乳腺癌的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移。Mu 等［13］的研究表明，乳酸可以通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（extracellular regulated protein kinases/signal transducer and activator of transcription3，ERK/STAT3）信號(hào)通路刺激巨噬細(xì)胞M2 型極化，以促進(jìn)乳腺癌增殖、遷移和血管生成，從而驅(qū)動(dòng)乳腺癌發(fā)展。本研究顯示，乳腺癌患者的腫瘤組織中的TAMs 呈M2型極化，極化后的TAMs 可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖以及遷移，說明巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞極化在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

近年越來越多的研究表明，F(xiàn)STL3 與癌癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。FSTL3 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)增加，在體外和體內(nèi)，敲低FSTL3 顯著抑制了肺癌細(xì)胞的活力和遷移、侵襲能力［14］。Razanajaona 等［15］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中FSTL3 通過抵消激活素來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。此外最新研究發(fā)現(xiàn)FSTL3 家族成員可作為乳腺癌的替代標(biāo)志物，也可以作為人類浸潤(rùn)性乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌TAMs 中FSTL3 的表達(dá)明顯增加，暗示FSTL3 影響TAMs 在乳腺癌中的作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在許多疾病模型中，F(xiàn)STL3 被證明和巨噬細(xì)胞之間存在相互作用。在動(dòng)脈粥樣硬化中，F(xiàn)STL3 促進(jìn)巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)積累，刺激巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子和趨化因子從而加重疾病的進(jìn)展［17］。Liu 等［7］發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者中FSTL3 表達(dá)與M2 浸潤(rùn)呈正相關(guān)，F(xiàn)STL3 的過表達(dá)促進(jìn)M2 型TAMs 的增殖，F(xiàn)STL3敲低后降低了胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。此外，F(xiàn)STL3 還可以通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞極化和T 細(xì)胞耗竭形成抑制性免疫微環(huán)境來加速結(jié)腸癌的發(fā)生［18］。本研究發(fā)現(xiàn)PMA/IL-4 誘導(dǎo)THP-1 向M2 型TAMs 極化后，F(xiàn)STL3 的表達(dá)水平增加，而沉默F(xiàn)STL3 有效拮抗PMA/IL-4 誘導(dǎo)THP-1 向M2 型TAMs 極化，說明FSTL3 能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化的過程。當(dāng)FSTL3 過表達(dá)時(shí)，能夠促進(jìn)TAMs對(duì)于MCF7 增殖、遷移及侵襲的作用，而沉默F(xiàn)STL3，將拮抗TAMs 對(duì)MCF7 細(xì)胞的促進(jìn)惡化作用。上述結(jié)果說明在乳腺癌中，F(xiàn)STL3 通過促進(jìn)TAMs 的M2 型分化，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，乳腺癌患者腫瘤組織中存在的TAMs 呈M2 型極化，F(xiàn)STL3 在TAMs 中呈現(xiàn)高表達(dá)。FSTL3 通過促進(jìn)TAMs 的M2 型極化增加了MCF7 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。以上結(jié)果初步明確了FSTL3 及M2 型TAMs 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，可為進(jìn)一步探討乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的思路。