普通煙草Dof轉錄因子家族的全基因組鑒定及分析

趙振祥，崔露瑩，周東波，趙澤玉，張銀霞，蓋夢琦，解敏敏，蒲文宣，彭 宇，李志遠*

普通煙草Dof轉錄因子家族的全基因組鑒定及分析

趙振祥1，崔露瑩2，周東波1，趙澤玉3，張銀霞1，蓋夢琦2，解敏敏2，蒲文宣1，彭 宇1，李志遠2*

（1.湖南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，長沙 410007；2.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，煙草行業(yè)基因資源利用重點實驗室，青島 266101；3.湖北中煙工業(yè)有限責任公司三峽卷煙廠，湖北 宜昌 443100）

Dof（DNA binding with one finger）蛋白是植物特有的一類轉錄因子，在植物的多種生命進程中發(fā)揮著重要作用。為解析煙草中Dof家族成員在生長發(fā)育過程中的潛在作用，本研究利用比較基因組學、進化分析、共線性分析等方法解析煙草中的Dof家族成員的潛在生物學功能。結果表明，在煙草基因組中共鑒定到69個Dof轉錄因子，其Dof功能域在進化上十分保守，根據(jù)系統(tǒng)進化分析結果將其劃分為9個亞家族。共線性分析表明，煙草中的16個基因與擬南芥17個基因有27個共線性基因對，同時，25個基因被檢測到存在17個全基因組復制對，表明復制事件在煙草基因家族的擴張中起關鍵作用。此外，表達模式分析表明基因的表達存在明顯的組織特異性，其中和基因可能與根系生長發(fā)育有關。本研究對煙草基因組中的Dof轉錄因子進行了系統(tǒng)的鑒定和分析，為煙草Dof轉錄因子家族成員的功能研究奠定了基礎。

普通煙草；Dof轉錄因子；鑒定；比較基因組學；表達模式

轉錄因子（Transcription factors, TFs）可以識別并結合下游靶基因啟動子上的順式作用元件，進而調控下游基因的表達[1]。DNA結合單鋅指蛋白（DNA binding with one finger, Dof）是植物特有的一類轉錄因子，其成員均含有一個由52個氨基酸組成的Dof保守功能域[2]。Dof功能域呈現(xiàn)為C2C2型鋅指結構，能夠特異識別序列為5'-AAAG-3'的順式作用元件[3-4]。Dof轉錄因子在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調控作用[5]。

研究表明，Dof轉錄因子參與種子萌發(fā)、組織分化以及碳氮代謝等生理生化過程[6-7]。例如，玉米中的基因與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的表達有關，且異源過表達基因能顯著提高轉基因擬南芥中的氮含量[8-9]。同時，在玉米中過表達能夠促進籽粒中淀粉的生物合成，而可溶性糖和還原糖的合成則受到抑制[10]。在水稻中，OsDOF18轉錄因子可以影響根系對氨的吸收和轉運[11]。在擬南芥中，過表達會影響植物細胞的大小和數(shù)量，導致植株矮化[12]。而可以抑制種子萌發(fā)，并且可通過調控種子萌發(fā)正向調節(jié)因子（TCP14）的表達來調控ABA脅迫相關基因的表達[13]。

Dof轉錄因子還被報道參與植物非生物脅迫反應。在擬南芥中，的表達受到鹽、干旱、高溫和脫落酸的誘導，并且過表達基因可提高擬南芥對非生物脅迫的耐受程度[14]。在番茄中，過表達的轉基因植株對干旱的抵抗能力顯著提升[15]。在小麥中，包括TaDof16、TaDof26和TaDof96在內的多個Dof轉錄因子被證實參與多種非生物脅迫反應[16]。

自第一個Dof轉錄因子從玉米中鑒定和克隆出來后[17]，不同植物中的Dof轉錄因子被陸續(xù)鑒定和分析。在擬南芥[5]、水稻[18]、小麥[16]和馬鈴薯[19]中分別鑒定了36、30、96和35個Dof轉錄因子。煙草是一類重要的葉用經(jīng)濟作物，同時也是用來研究基因功能的重要模式生物。目前，已有部分煙草Dof轉錄因子的功能被鑒定。例如，在煙草中過表達可以激活基因的轉錄，進而增強轉基因植株對煙草花葉病毒病的抗性[20]。此外，和基因同樣也被證明在煙草防御反應中發(fā)揮著重要作用[21]。SIERRO等[22]在2014年公布了白肋煙TN90和烤煙K326的參考基因組?；诎桌邿烼N90的參考基因組，WEI等[23]在白肋煙中鑒定到60個Dof轉錄因子，并將其分為8個不同類群，但并未進行深入分析。2017年，Edwards進一步提高了烤煙K326基因組的組裝質量，將其組裝到染色體水平[24]。上述研究為全基因組水平上煙草基因家族的鑒定和分析奠定了基礎。

本研究根據(jù)最新組裝的烤煙K326基因組，對普通煙草中存在的Dof轉錄因子進行了全面鑒定，并通過系統(tǒng)進化分析、共線性分析和表達模式分析等手段對Dof轉錄因子進行了研究。為解析煙草Dof家族成員在生長發(fā)育和組織分化等過程中的潛在作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為普通煙草烤煙品種K326，2021年3月種植于煙草行業(yè)基因資源利用重點實驗室人工氣候室內。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草Dof轉錄因子成員的鑒定和序列分析 普通煙草K326蛋白組數(shù)據(jù)庫從茄科數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）下載，并分別在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和TAIR數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）中下載已報道的白肋煙TN90[23]和擬南芥的Dof蛋白序列[5]。以擬南芥Dof蛋白序列作為種子序列檢索K326蛋白組數(shù)據(jù)庫（E-value＜0.01），得到候選序列。使用SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫進一步篩選，去除不含有Dof功能域的序列[25-26]。使用ProtParam工具對煙草Dof成員的理化性質進行分析[27]。

1.2.2 煙草Dof家族成員的多序列比對及系統(tǒng)進化分析 使用MAFFT軟件將新鑒定的煙草Dof成員和已報道的擬南芥Dof成員的蛋白序列進行多序列比對[28]。其中Dof功能域序列的比對結果用TBtools軟件進行可視化分析[29]。另外根據(jù)多序列比對結果，使用MEGA X在默認參數(shù)下構建鄰接樹[30]。

1.2.3 保守基序分析 將擬南芥和煙草的Dof蛋白序列提交至MEME網(wǎng)站，進行其保守基序分析，參數(shù)設置如下：保守基序數(shù)量設定為10，保守基序長度設定為6至100，并選擇ZOOPS scoring模式進行分析[31]。

1.2.4 煙草基因的復制事件及共線性分析 首先使用普通煙草K326的全基因組序列與擬南芥的全基因組序列進行比對分析。利用McScan X軟件在默認參數(shù)下進行普通煙草基因組和擬南芥基因組的共線性分析[32]。使用ColinearScan軟件對煙草基因的復制事件進行鑒定和分析[33]。

1.2.5 轉錄組數(shù)據(jù)處理及結果分析 在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(登錄號：GSE95717)中下載煙草基因在出苗后8周的根、莖和莖尖組織表達數(shù)據(jù)[24]，使用R語言中HeatMap函數(shù)繪制不同組織的表達熱圖[34]。

2 結 果

2.1 煙草Dof轉錄因子家族成員鑒定和理化分析

根據(jù)擬南芥Dof蛋白序列對煙草蛋白數(shù)據(jù)庫進行檢索，得到的候選序列用Pfam數(shù)據(jù)庫分析候選序列含有的Dof保守結構域后，最終共在普通煙草K326基因組中鑒定到69個煙草Dof轉錄因子。根據(jù)基因在染色體上的定位，對69個基因進行重命名（-）。如表1所示，煙草Dof轉錄因子成員在理化性質上存在差異，其中氨基酸數(shù)目在128～527之間，相對分子量大小在14.70 ～58.48 kDa之間，而其成員的理論等電點在4.51～9.78之間（表1）。

表1 普通煙草Dof轉錄因子家族成員鑒定及理化性質分析

表1 （續(xù)）

2.2 煙草Dof家族成員保守結構與進化分析

煙草中的Dof功能域（圖1A）和擬南芥的Dof功能域（圖1B）極為相似，這說明Dof轉錄因子在物種進化過程中是高度保守的。特別地，在C1、C4、C26和C29等位點完全保守，暗示這些位點對Dof轉錄因子發(fā)揮其生物學功能起著重要的作用。

系統(tǒng)進化分析表明（圖2），普通煙草K326中新鑒定的Dof成員可劃分為9個亞家族。值得注意的是，所有的亞家族均含有擬南芥和煙草的Dof轉錄因子，暗示擬南芥和煙草的物種分化時間要晚于Dof轉錄因子的分化時間。特別地，在部分亞家族中煙草Dof成員的數(shù)量遠多于擬南芥。例如，在亞家族III和VIII中分別含有1個擬南芥Dof轉錄因子，而普通煙草K326中上述兩個亞家族均存在4個Dof轉錄因子。這說明在普通煙草和擬南芥物種分化后，第III和VIII亞家族的成員又經(jīng)歷了復制事件，導致了上述亞家族成員的擴張。

普通煙草K326和白肋煙TN90中的Dof轉錄因子相比，在III和VII亞家族中的Dof轉錄因子具有一一對應的關系。然而，在白肋煙TN90中鑒定到的亞家族IV、VI和VIIIDof轉錄因子數(shù)量明顯少于普通煙草K326。特別地，在亞家族VI中含有4個由普通煙草K326鑒定到的Dof轉錄因子，而白肋煙TN90的Dof轉錄因子在此亞家族中不存在。在亞家族I和V中，由白肋煙TN90鑒定到的Dof轉錄因子數(shù)量則明顯多于普通煙草K326（圖2）。

注：*代表在Dof結構域中保守的半胱氨酸。Note: * represents the conserved cysteine residues in the Dof domain.

圖2 煙草Dof家族成員的系統(tǒng)進化分析

2.3 煙草Dof家族成員蛋白保守基序分析

利用MEME在線工具對擬南芥和煙草Dof成員的保守基序進行了分析（圖3）。結果顯示，相同亞家族Dof成員的保守基序組成和排列具有相似性，暗示相同亞家族的Dof成員可能行使著類似的功能。Dof功能域由motif1和motif2組成，在所有煙草Dof轉錄因子中均存在該結構域。特別地，某些保守基序是部分亞家族所特有的，比如Motif10僅在第II亞家族存在，表明Motif10可能對第II亞家族成員的功能具有重要作用。

2.4 煙草Dof家族成員的共線性分析

為進一步分析Dof家族成員在擬南芥和煙草兩個物種中的分化關系，使用McScan X對兩個物種的基因組進行共線性分析。如圖4所示，At01-At05和Nt01-Nt24分別代表擬南芥的5條染色體和煙草的24條染色體，其中灰色線條代表擬南芥和煙草所有的共線基因對，紅色線條表示基因。結果顯示，來自擬南芥基因組的17個Dof家族成員與來自煙草中的16個Dof成員共組成27個共線基因對。共線性分析結果進一步說明所鑒定的煙草與擬南芥的基因直系同源。

2.5 煙草Dof家族成員的全基因組復制事件分析

全基因組復制分析可以更好地解析NtDof家族成員的進化關系，利用McScan X對煙草基因組進行復制事件分析。如圖5所示，灰色線條表示煙草基因組中所有的復制基因對，而紅色線條表示煙草基因間形成的復制基因對。結果表明，煙草基因組中共有25個基因共形成17個全基因組復制基因對，表明這些基因來源于一次或多次復制事件，同時全基因組復制事件在煙草Dof轉錄因子家族的擴張過程中發(fā)揮重要作用。

圖3 普通煙草Dof家族成員的保守基序分析

圖4 煙草和擬南芥Dof基因的共線性分析

圖5 煙草Dof基因全基因組復制分析

2.6 煙草Dof基因不同組織表達模式分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載并提取煙草基因在根、莖和莖尖中的表達數(shù)據(jù)，使用Heatmap程序進行可視化展示（圖6）。結果所示，新鑒定的煙草基因3個測試組織中的表達模式各不相同。其中，、、和等9個基因未檢測到表達，而、和等基因在所有組織中均有表達。此外個別基因的表達具有組織特性行為，例如、和在莖尖中表達量較高，而和僅在根處檢測到表達且表達量處于較低水平。特別地，和基因在根中高表達，而在莖和莖尖中的表達則處于較低水平，說明這兩個基因可能參與植物根系生長發(fā)育過程。

圖6 煙草Dof基因家族成員的表達模式分析

3 討 論

本研究采用比較基因組學的方法對煙草基因組中的Dof轉錄因子進行了鑒定，并從系統(tǒng)進化、共線性、復制事件、保守基序和表達模式等方面對新鑒定的煙草Dof轉錄因子進行了分析。

本研究發(fā)現(xiàn)所鑒定的煙草Dof轉錄因子均含有高度保守的Dof功能域，證明Dof蛋白在物種的進化過程中是高度保守的。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，煙草和擬南芥的Dof家族成員可劃分為9個亞家族，并且所有亞家族均含有煙草和擬南芥的成員，暗示在進化過程中Dof轉錄因子家族的分化時間要早于煙草和擬南芥的物種分化時間。復制事件分析結果表明，煙草中共有25個基因發(fā)生了復制事件，證明復制事件在煙草Dof家族擴張過程中起關鍵性作用。

WEI等[23]對白肋煙TN90中Dof轉錄因子進行了篩選，共鑒定到60個Dof轉錄因子。本研究對普通煙草K326基因組中的Dof轉錄因子進行了鑒定，共鑒定到69個Dof轉錄因子。在進化過程中，白肋煙TN90和普通煙草K326的部分基因可能發(fā)生了丟失或復制，因此導致鑒定到的Dof轉錄因子數(shù)量產(chǎn)生差異。另一方面，EDWARDS等[24]對普通煙草K326的基因組進行了重新組裝和注釋，進一步提高了普通煙草K326的基因組質量。本研究根據(jù)質量更高的普通煙草K326基因組對Dof轉錄因子進行鑒定，鑒定結果更加準確，更有利于下一步開展基因功能研究。

在亞家族I中，與和、、等基因聚在一起且直系同源。此外與被報道參與擬南芥種子的萌發(fā)[35-37]，推測、和等基因可能在煙草種子的發(fā)育過程中起關鍵作用。此外，全基因組復制分析發(fā)現(xiàn)，分別和、組成復制基因對，說明在煙草和擬南芥物種分化之后，第I亞家族中的煙草Dof成員可能又經(jīng)歷了復制事件。此外，在第IV、V亞家族中也有類似的情況，說明復制事件對煙草Dof轉錄因子家族的擴張具有重要意義。

在擬南芥中，一些基因被報道參與調控植物的生長發(fā)育。例如，（）被證實調控植物根系生長發(fā)育過程[38]。在煙草中，基因與組成共線性基因對，二者直系同源。同時，在根中的表達量顯著高于其他組織，說明基因可能在根系生長發(fā)育過程中發(fā)揮調控作用。此外，在第VI亞家族中，AtDof5.1被報道可調控葉片的卷曲程度[39]。在煙草中，NtDof02、NtDof11、NtDof33、NtDof36和NtDof37與AtDof5.1聚類在一起，并且進一步分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白的編碼基因分別和形成共線基因對。有意思的是，他們的表達模式卻有差別，例如和在根部的表達量較高，在3個測試組織中均未見表達，說明此家族的Dof成員在功能上可能出現(xiàn)了分化。

4 結 論

本研究利用生物信息學方法從煙草基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定到了69個Dof轉錄因子。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)煙草和擬南芥Dof成員可劃分為9個亞家族，并且同一亞家族成員的保守基序組成具有相似性，暗示其可能在功能上具有相似性。另外全基因組復制事件分析發(fā)現(xiàn)復制事件在煙草Dof轉錄因子家族的擴張中起著重要的作用。表達模式分析表明，基因的表達存在組織特異性，可能在植物生長發(fā)育及組織分化過程中發(fā)揮著重要作用。

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Genome-wide Identification and Systemic Analysis of Dof Transcription Factors in Tobacco (L.)

ZHAO Zhenxiang1, CUI Luying2, ZHOU Dongbo1, ZHAO Zeyu3, ZHANG Yinxia1, GE Mengqi2,XIE Minmin2, PU Wenxuan1, PENG Yu1, LI Zhiyuan2*

（1. Technology Center, China Tobacco Hunan Industrial, Changsha 410007, China; 2. Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Institute of Tobacco Research of CAAS, Qingdao 266101, China; 3. Sanxia Cigarette Factory, China Tobacco Hubei Industrial Co., Ltd., Yichang, Hubei 443100, China）

As a plant specific transcription factor family, Dof proteins play important roles in multiple life processes of plant development. To analyze the potential roles of Dof family members in tobacco growth and development, comparative genomics, evolutionary analysis and syntenic analysis were performed to analyze potential function of NtDof members. A total of 69 Dof transcription factors were identified in the tobacco genome, and the Dof domain was highly conserved. The NtDof members were classified into 9 subfamilies based on the phylogenetic analysis. In tobacco, 16genes were found to form 27 collinear pairs with 17genes. The duplication events showed that 25genes were detected to form 17 replication pairs, suggesting that replication events play a key role in the expansion of the tobacco Dof gene family. Furthermore, the expression ofgenes have obvious tissue specificity.andgenes may be involved in root development. Tobacco Dof transcription factors were identified and analyzed in this study, and these results may provide insights for further studies on tobacco Dof family.

tobacco; Dof transcription factors; identification; comparative genomics; expression pattern

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.010

S572.01

A

1007-5119（2022）04-0070-09

湖南中煙工業(yè)有限責任公司科技項目（KY2020YC0013）；中國煙草總公司重大專項項目[110201901018（JY-05）]

趙振祥（1969-），男，農(nóng)藝師，主要從事煙草栽培調制與基因功能研究。E-mail：691890770@qq.com。*通信作者，E-mail：lizhiyuan02@caas.cn

2021-11-11

2022-03-04