遵義煙區(qū)雜草調(diào)查及海洋雜色曲霉提取物除草效果研究

王 美，王先勃，馬斯琦，彭治鑫，劉榮欣，張成省，萬(wàn) 軍，溫明霞，吳慧子，祝乾湘，韓小斌*，趙棟霖*

遵義煙區(qū)雜草調(diào)查及海洋雜色曲霉提取物除草效果研究

王 美1，王先勃2，馬斯琦1，彭治鑫1，劉榮欣1，張成省1，萬(wàn) 軍2，溫明霞2，吳慧子2，祝乾湘2，韓小斌2*，趙棟霖1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000）

為了開(kāi)發(fā)新型、安全、高效的天然產(chǎn)物除草劑，采用倒置“W”九點(diǎn)取樣法和三層三級(jí)目測(cè)法對(duì)貴州省遵義市道真縣和余慶縣煙田雜草危害情況進(jìn)行調(diào)查，明確優(yōu)勢(shì)雜草種類(lèi)和防治需求；對(duì)具有顯著除雙子葉雜草活性的海洋雜色曲霉D5進(jìn)行發(fā)酵提取，明確活性成分及含量；進(jìn)而采用莖葉噴霧法評(píng)價(jià)D5發(fā)酵提取物的田間除草效果。結(jié)果表明：（1）道真煙田中共有9科15種雜草發(fā)生，以雙子葉菊科種類(lèi)最多，以莧科相對(duì)多度值最高，占比高達(dá)84.2%，是優(yōu)勢(shì)雜草；余慶煙田中共有16科39種雜草發(fā)生，危害度為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)的雜草分別有29種、9種、1種，危害度達(dá)到Ⅲ級(jí)的為雙子葉雜草蓼；（2）海洋雜色曲霉D5發(fā)酵提取物在10%乙酸乙酯-石油醚洗脫后，采用100%乙酸乙酯洗脫，濃縮后活性物質(zhì)基本無(wú)損失，包含柄曲霉素ST（14.6%）和二氫柄曲霉素DHST（0.4%）；（3）田間小區(qū)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D5發(fā)酵提取物在低施藥量（675 g/hm2）下具有顯著的除草作用，特別是對(duì)雙子葉雜草具有明顯的抑制效果，以對(duì)玄參科雜草婆婆納最為顯著，鮮質(zhì)量防效達(dá)到61.4%；同時(shí)，對(duì)狗尾草和打碗花的鮮質(zhì)量防效亦達(dá)到50%以上。由此可見(jiàn)，海洋雜色曲霉D5發(fā)酵提取物抗草譜廣，對(duì)雙子葉雜草除草作用明顯，具有開(kāi)發(fā)成為天然產(chǎn)物除草劑的潛力。

煙草；雜草調(diào)查；天然產(chǎn)物除草劑；海洋雜色曲霉；次級(jí)代謝產(chǎn)物

遵義市位于貴州省北部，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，雨量豐沛，為煙草的生長(zhǎng)提供了優(yōu)良的氣候條件，但同時(shí)也促進(jìn)了雜草的繁殖。煙田雜草與煙草爭(zhēng)奪陽(yáng)光、水分、肥料、空間，干擾煙草的正常生長(zhǎng)，影響煙葉的產(chǎn)量產(chǎn)值，給煙葉生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失[1-3]。目前煙田除草的主要方法是化學(xué)和人工防除。然而人工除草費(fèi)時(shí)費(fèi)力，隨著勞動(dòng)力成本的大幅提高，人工除草面臨著巨大的成本壓力?；瘜W(xué)除草劑的長(zhǎng)期大量使用容易帶來(lái)藥害和環(huán)境安全隱患，嚴(yán)重威脅煙草質(zhì)量和人畜安全[4-6]。目前，全世界已經(jīng)有100余種化學(xué)除草劑在30多個(gè)國(guó)家被禁用或取消登記[7]。由此可見(jiàn)，化學(xué)除草劑所帶來(lái)的負(fù)面作用已經(jīng)引起全球范圍的廣泛關(guān)注，亟需尋找化學(xué)除草劑的替代品，加快生物和天然產(chǎn)物除草劑的開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。雖然我國(guó)在生物除草劑的研究上已經(jīng)取得了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的技術(shù)成果，但是很多沒(méi)有成功商品化，至今沒(méi)有開(kāi)發(fā)成為成熟的產(chǎn)品。

本課題組前期從海洋雜色曲霉D5發(fā)酵提取物中分離純化得到2個(gè)xanthone類(lèi)除草活性化合物柄曲霉素sterigmatocystin（ST）和二氫柄曲霉素dihydrosterigmatocystin（DHST）。盆栽試驗(yàn)條件下，二者對(duì)反枝莧、刺莧、綠莧等雙子葉雜草表現(xiàn)出明顯的除草活性，其中ST對(duì)反枝莧的抑制作用為對(duì)照草甘膦的4倍，DHST的除草活性與草甘膦相當(dāng)，兩種物質(zhì)是D5發(fā)酵提取物產(chǎn)生除草作用的主要活性成分[8]。基于前期試驗(yàn)成果，本研究調(diào)查了遵義煙區(qū)主要雜草類(lèi)型，優(yōu)勢(shì)雜草為雙子葉雜草，屬于D5提取物的抗草譜范圍，且種類(lèi)數(shù)量繁多，亟需進(jìn)行雜草防控干預(yù)；對(duì)D5進(jìn)行發(fā)酵和活性組分提取，確認(rèn)活性成分及含量，并在遵義煙區(qū)開(kāi)展田間除草效果評(píng)價(jià)，為新型天然產(chǎn)物除草劑的開(kāi)發(fā)提供產(chǎn)品支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2021年6月在貴州省遵義市道真縣和余慶縣開(kāi)展。

1.2 菌株來(lái)源

試驗(yàn)所用海洋真菌分離自山東青島沿海一種未鑒定的海藻，通過(guò)形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)方法鑒定為雜色曲霉。菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為CGMCC NO.15386。

1.3 試劑

馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDW，青島海博生物技術(shù)有限公司）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，青島海博生物技術(shù)有限公司）；色譜純、分析純甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；色譜純、分析純乙腈（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；分析純二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、二甲亞砜（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；化學(xué)純吐溫80（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.4 貴州遵義煙田雜草危害情況調(diào)查

隨機(jī)選取道真面積約為0.125 hm2煙田田地?cái)?shù)塊，采用倒置“W”九點(diǎn)取樣法[1,9]，每塊田塊確定九個(gè)取樣點(diǎn)，每點(diǎn)選用0.25 m2（0.5 m×0.5 m）正方形樣方進(jìn)行取樣，以莖稈數(shù)為單位分別記載樣框內(nèi)全部雜草的種類(lèi)及數(shù)量。為了量化調(diào)查數(shù)據(jù)，采用田間均度（、田間密度（）、頻度（）3個(gè)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，得到相對(duì)均度（）、相對(duì)密度（）、相對(duì)頻度（），用相對(duì)多度（）表示某種雜草在雜草群落中所占的比重[1,9]。

隨機(jī)選取余慶面積約為0.125 hm2煙田數(shù)塊，采用三層三級(jí)目測(cè)法[10]，分別用Ⅰ級(jí)（輕）、Ⅱ級(jí)（中）、Ⅲ級(jí)（重）對(duì)煙田雜草危害情況進(jìn)行等級(jí)劃分。

1.5 發(fā)酵提取物除草活性成分的分離鑒定

本課題組前期研究報(bào)道了D5發(fā)酵提取物中的主要除草活性成分為ST和DHST[8]，活性化合物提取分離過(guò)程為：將D5菌株用PDW培養(yǎng)基（100 L）于28 ℃靜置培養(yǎng)30 d，將菌液和菌體通過(guò)紗布過(guò)濾分離。菌液用兩倍體積乙酸乙酯萃取3遍。菌體用甲醇-二氯甲烷（1∶1）提取后減壓蒸干溶劑，剩余的水溶液用等體積乙酸乙酯萃取3遍。將菌液和菌體的乙酸乙酯萃取液混合，減壓蒸干后得到D5發(fā)酵提取物。該提取物依次用乙酸乙酯-石油醚（0～100%）、甲醇-乙酸乙酯（0～50%）經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行洗脫，得到7個(gè)組分（Fr.1～Fr.7）。Fr.4用甲醇-水（30%～90%）經(jīng)ODS柱層析進(jìn)行洗脫，然后用甲醇-二氯甲烷（1∶1）經(jīng)凝膠柱LC-20層析，得到7個(gè)組分（Fr.4-1～Fr.4-7）。將組分Fr.4-1用乙腈-水（1∶1）經(jīng)反相高效液相色譜分析制備，得到了兩個(gè)純化合物，經(jīng)1H NMR、13C NMR和ESI-MS分析，確定為化合物ST和DHST。本課題為了進(jìn)行田間試驗(yàn)，需要進(jìn)一步將雜色曲霉D5進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵，以便富集發(fā)酵提取物。

1.6 用于田間試驗(yàn)的D5發(fā)酵提取物的制備

配制125 mL PDW培養(yǎng)基，置于250 mL的發(fā)酵瓶中，高壓蒸汽滅菌。將雜色曲霉D5于PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，待生長(zhǎng)3～5 d時(shí)，挑取菌餅（=5 mm）加入其中，發(fā)酵10瓶。于180 r/min、28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)72 h，獲得菌株種子液。稱(chēng)取90 g大米置于1 L的發(fā)酵瓶中，加入3%粗海鹽水110 mL，共配制200瓶大米培養(yǎng)基，滅菌。于滅菌后的大米培養(yǎng)基中分別加入5 mL菌株種子液，28 ℃靜置培養(yǎng)40 d發(fā)酵。

發(fā)酵完畢后，按照1.5中萃取步驟進(jìn)行操作，最終共獲得發(fā)酵提取物319.8 g。為了簡(jiǎn)化提取流程并最大限度發(fā)揮提取物的除草作用，將發(fā)酵提取物進(jìn)行減壓硅膠柱層析以便除去脂肪酸、糖類(lèi)和蛋白質(zhì)等非活性組分。依次以乙酸乙酯-石油醚（10%）、乙酸乙酯-石油醚（100%）、甲醇-乙酸乙酯（10%）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，劃分為3個(gè)組分（Fr.1～Fr.3）。然后通過(guò)TLC和HPLC分析，確定乙酸乙酯-石油醚（100%）洗脫下來(lái)的部分含ST（14.6%）和DHST（0.4%），共79 g提取物，用于田間試驗(yàn)。

1.7 發(fā)酵提取物除草活性田間小區(qū)試驗(yàn)

試驗(yàn)田共60 m2，平均劃分為6塊，分別作為田間試驗(yàn)的處理組和對(duì)照組，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。用含0.2%吐溫80的水溶解D5發(fā)酵提取物至1 g/L濃度（含ST 0.146 g/L，DHST 0.004 g/L），作為處理組；含0.2%吐溫80的水作為對(duì)照組。待雜草長(zhǎng)成規(guī)模時(shí)，選擇晴朗無(wú)風(fēng)、未來(lái)48 h內(nèi)無(wú)雨天氣，采用噴霧法，使用3WBD-20型背負(fù)式電動(dòng)噴霧器，按照675 g/hm2劑量均勻定向噴灑至樣地內(nèi)所有雜草的葉面、莖稈，整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)只噴藥一次，15 d后統(tǒng)計(jì)除草效果。

利用公式進(jìn)行計(jì)算：雜草鮮質(zhì)量防效[11]=（對(duì)照組雜草鮮質(zhì)量?處理組雜草鮮質(zhì)量）/對(duì)照組雜草鮮質(zhì)量×100%。為了更詳盡地描述施藥效果，進(jìn)一步測(cè)量雜草的全長(zhǎng)、主根長(zhǎng)，測(cè)定干燥失重比。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析與作圖，SPSS 18.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，ChemDraw軟件進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)繪制。

2 結(jié) 果

2.1 貴州遵義主要煙田雜草危害情況調(diào)查

道真煙田雜草調(diào)查（表1）結(jié)果顯示，所調(diào)查樣地內(nèi)共有9科15種雜草，包括菊科6種、蓼科2種、石竹科1種、鴨跖草科1種、車(chē)前科1種、莧科1種、蕁麻科1種、豆科1種、天南星科1種。以菊科雜草種最多，包括牛膝菊、鱧腸、薊、馬蘭、豚草、菊芋6種雜草；以莧科雜草莧數(shù)量最多，相對(duì)多度值達(dá)84.2，蓼科雜草蓼次之，相對(duì)多度值為57.1，二者顯著多于其他雜草，屬于所調(diào)查區(qū)塊的優(yōu)勢(shì)雜草。

余慶煙田雜草調(diào)查結(jié)果（表2）顯示，就雜草種類(lèi)而言，所調(diào)查樣地內(nèi)共有16科39種雜草發(fā)生。危害度為Ⅰ級(jí)的雜草有15科29種，包括禾本科2種、蓼科1種、菊科7種、傘形科2種、莧科3種、十字花科2種、石竹科2種、景天科1種、唇形科2種、藜科2種、大戟科1種、玄參科1種、酢漿草科1種、茄科1種、毛莨科1種，占所有雜草種的74.3%；危害度為Ⅱ級(jí)的雜草有6科9種，包括禾本科4種、蓼科1種、菊科1種、傘形科1種、景天科1種、鴨跖草科1種，占所有雜草種的23.1%；危害度為Ⅲ級(jí)的雜草有1科1種，為蓼科雜草蓼，占所有雜草種的2.6%?？梢?jiàn)，蓼的危害級(jí)別最高，屬于余慶地區(qū)優(yōu)勢(shì)雜草。

綜上所述，所調(diào)查的遵義煙田的雜草危害不容忽視，優(yōu)勢(shì)雜草為雙子葉雜草，需要進(jìn)行人為干預(yù)，以保證煙草產(chǎn)量和質(zhì)量。

2.2 發(fā)酵提取物除草活性成分結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

D5菌株經(jīng)大米培養(yǎng)基發(fā)酵，后經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑提取濃縮后，得到發(fā)酵提取物，其除草活性成分是ST和DHST，含量分別為14.6%和0.4%，二者均為xanthone類(lèi)化合物。前期盆栽試驗(yàn)表明，兩個(gè)化合物對(duì)雙子葉雜草具有明顯的除草效果。通過(guò)核磁共振氫譜1H-NMR、碳譜13C-NMR和質(zhì)譜ESIMS 解析明確了活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

表1 道真煙田雜草調(diào)查結(jié)果

表2 余慶煙田雜草調(diào)查結(jié)果

ST：該化合物為淡黃色針狀物。根據(jù)1H-NMR（400 MHz，CDCl3）、13C-NMR（100 MHz，CDCl3）和ESIMS數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。在1H-NMR中給出了12個(gè)氫信號(hào)，包括8個(gè)芳香氫信號(hào)（δH7.49、2個(gè)δH6.82、δH6.75、δH6.50、δH6.43、δH5.44、δH4.80），高場(chǎng)區(qū)給1個(gè)甲氧基信號(hào)δH3.99，低場(chǎng)區(qū)給出1個(gè)羥基信號(hào)δH13.21。13C-NMR中給出了18個(gè)碳信號(hào)，包括8個(gè)季碳信號(hào)（δC164.7、δC163.4、δC162.5、δC155.1、δC154.2、δC109.1、δC106.7、δC106.1），8個(gè)次甲基信號(hào)（δC145.5、δC135.8、δC113.4、δC111.4、δC106.0、δC102.7、δC90.7、δC48.2），1個(gè)羰基碳信號(hào)δC181.5，1個(gè)甲氧基信號(hào)δC56.9。質(zhì)譜ESIMS 給出分子離子峰/325.07 [M + H]+，相對(duì)分子量為324，推斷其分子式為C18H12O6。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因而確定該化合物為sterigmatocystin。

DHST：該化合物為淡黃色針狀物。1H-NMR顯示該化合物與ST數(shù)據(jù)相似，只是少了δH6.75和δH5.44兩個(gè)氫信號(hào)，但是多了4個(gè)氫信號(hào)：δH4.18、δH3.67、2個(gè)δH2.30，推測(cè)DHST中C-9和C-10之間的雙鍵被還原。13C-NMR中，與ST相比，δC145.5和δC102.7向高場(chǎng)位移至δC67.9和δC31.5，進(jìn)一步驗(yàn)證了C-9和C-10之間的雙鍵被還原的推測(cè)。質(zhì)譜ESIMS 給出分子離子峰/327.09 [M + H]+，相對(duì)分子量為326，推斷其分子式為C18H14O6。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因而確定該化合物為dihydrosterigmatocystin。

2.3 發(fā)酵提取物除草活性田間試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)調(diào)查，遵義煙區(qū)雜草以雙子葉為主，而前期盆栽試驗(yàn)表明，D5提取物活性成分對(duì)雙子葉雜草具有顯著的除草活性，因此進(jìn)一步在遵義煙區(qū)開(kāi)展田間防效評(píng)價(jià)。鮮質(zhì)量防效結(jié)果（表3）顯示，在處理組與對(duì)照組的6塊煙田里均存在菊科艾、禾本科狗尾草、玄參科婆婆納、毛茛科毛茛、旋花科打碗花等5種雜草，其中4種為雙子葉雜草。D5對(duì)狗尾草、婆婆納和打碗花的鮮質(zhì)量防效均高于50%?？梢?jiàn)D5發(fā)酵提取物對(duì)此3種雜草均具有明顯的防除作用，且狗尾草和婆婆納的處理組與對(duì)照組差異顯著（<0.05），尤其對(duì)婆婆納除草活性最為顯著，鮮質(zhì)量防效達(dá)61.4%。

表3 施藥后雜草鮮質(zhì)量防效結(jié)果

注：同行數(shù)據(jù)后帶有*者代表處理間差異顯著（<0.05）。下同。

Note: Those with * after the peer data showed significant differences between treatments (<0.05). The same below.

由圖1結(jié)果顯示，D5發(fā)酵提取物對(duì)艾、狗尾草和婆婆納的全長(zhǎng)具有明顯抑制作用，抑制率分別為50.8%、51.7%、41.1%，處理組與對(duì)照組差異顯著（<0.05）。圖2結(jié)果顯示，D5發(fā)酵提取物對(duì)狗尾草的主根長(zhǎng)具有明顯抑制作用，抑制率為25.0%，處理組與對(duì)照組差異顯著（<0.05）。

雜草的干燥失重比（圖3）顯示，D5發(fā)酵提取物對(duì)5種雜草的干燥失重比無(wú)明顯抑制作用，處理組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（<0.05）。

可見(jiàn)，D5發(fā)酵提取物對(duì)不同雜草的影響不一樣，其中對(duì)艾和婆婆納的全長(zhǎng)有顯著影響，對(duì)狗尾草的主根長(zhǎng)有顯著影響，能明顯降低婆婆納、狗尾草和打碗花的鮮質(zhì)量。5種雜草隸屬于不同科，可見(jiàn)D5發(fā)酵提取物抗草譜較廣，低施藥量（675 g/hm2）即可對(duì)雜草產(chǎn)生明顯的防除作用。

圖1 施藥后雜草全長(zhǎng)

圖2 施藥后雜草主根長(zhǎng)

圖3 施藥后雜草干燥失重比

3 討 論

化學(xué)除草劑極大地促進(jìn)了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，但其所帶來(lái)的諸多負(fù)面影響也日益凸顯，能夠造成諸如環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、食品安全、作物藥害和雜草抗性等一系列問(wèn)題。孫宏宇等[14]用54種常用除草劑對(duì)煙草進(jìn)行莖葉噴霧誘發(fā)藥害試驗(yàn)，結(jié)果顯示絕大多數(shù)除草劑可對(duì)煙草產(chǎn)生抑制、死亡等不同程度藥害。2021年，房寬等[15]研究發(fā)現(xiàn)煙稻輪作區(qū)，兩種稻田用除草劑2,4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸殘留可引起煙株矮化、莖稈扭曲以及煙葉卷曲。其次，化學(xué)除草劑施藥過(guò)程中可能會(huì)順風(fēng)漂移，造成周?chē)h(huán)境和臨近作物受到污染，嚴(yán)重危害食品安全[1]。2005年，某水田農(nóng)戶(hù)將莖葉類(lèi)除草劑噴施于稻田埂上，其揮發(fā)的有害氣體順風(fēng)漂移近2 km，造成大面積正在通風(fēng)降溫的棚室甜瓜停止生長(zhǎng)甚至死亡[16]。最后，長(zhǎng)期大量使用化學(xué)除草劑，雜草抗藥性問(wèn)題日益突出。截至2020年，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)44種74個(gè)雜草生物型對(duì)11類(lèi)38種化學(xué)除草劑產(chǎn)生抗藥性[17]。2019年，朱曉明等[18]研究了對(duì)玉米田除草劑不同耐藥水平煙草葉面微生物情況，推測(cè)葉面大量抗藥性菌株可能對(duì)煙草耐藥性產(chǎn)生了積極作用。2021年，韓曉雪等[19]報(bào)道，湖南省由于雜草對(duì)除草劑雙氯甲酸產(chǎn)生抗性，稻田畝產(chǎn)量減產(chǎn)約30%。本研究調(diào)查了遵義道真和余慶煙區(qū)的雜草類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)雜草種類(lèi)繁多，包括20科49種，以雙子葉雜草莧和蓼數(shù)量最多，危害最重，亟需進(jìn)行人工干預(yù)，以保證煙草產(chǎn)量和質(zhì)量。然而，由于煙草對(duì)化學(xué)除草劑極為敏感，貴州煙區(qū)當(dāng)季藥害嚴(yán)重，并且殘留藥害也極為明顯，造成煙葉產(chǎn)量損失極大。因此，目前貴州煙區(qū)禁用化學(xué)除草劑。人工除草成本高，且勞動(dòng)強(qiáng)度大，只有當(dāng)雜草危害十分嚴(yán)重時(shí)，煙農(nóng)才會(huì)進(jìn)行除草作業(yè)，這也制約了煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量的提升。由此可見(jiàn)，新型生物除草劑的開(kāi)發(fā)已成為迫在眉睫的問(wèn)題。

目前，全球注冊(cè)的生物除草劑產(chǎn)品有20多個(gè)[7]。我國(guó)現(xiàn)已初步建立起了生物除草劑研究的技術(shù)體系。2018年，朱海霞等[20]研究發(fā)現(xiàn)感病微孔草根際土壤真菌鐮孢菌GD-5對(duì)藜和密花香薷有較強(qiáng)的致病性。2019年，張金新等[21]發(fā)現(xiàn)植株病葉真菌間座殼屬菌發(fā)酵液對(duì)稗草和反枝莧根具有較好的抑制作用。2021年，吳兆圓等[22]從罹病的馬唐草上獲得一株鏈格孢菌，其發(fā)酵液能明顯抑制馬唐幼苗的生長(zhǎng)。2022年，牛學(xué)禮等[23]發(fā)現(xiàn)根腐離蠕孢菌對(duì)禾本科雜草狗牙根、牛筋草、硬骨草等具有較強(qiáng)的致病力。值得注意的是，海洋微生物由于生長(zhǎng)在海洋獨(dú)特的水體環(huán)境中，具有不同于陸地微生物的特殊遺傳和代謝機(jī)制，更有可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣、生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，近年來(lái)逐漸成為生物農(nóng)藥研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。

然而，關(guān)于海洋微生物除草活性的研究近乎空白。本課題組在國(guó)際上較早開(kāi)展了海洋真菌除草活性物質(zhì)的研究工作，發(fā)現(xiàn)海洋微生物是除草活性化合物的潛在來(lái)源。2018年，從鏈格孢屬真菌P8中分離到5個(gè)對(duì)反枝莧和生菜幼苗生長(zhǎng)有明顯抑制作用的活性物質(zhì)[24]。2019年，發(fā)現(xiàn)1株鉤狀木霉HT10和1株哈茨木霉1HT對(duì)反枝莧生長(zhǎng)具有抑制作用[25]。2019年和2022年從木賊鐮刀菌D39中獲得一系列3DTA類(lèi)化合物，能夠明顯抑制反枝莧、生菜和綠莧幼苗生長(zhǎng)[26-27]。2022年，從菌核青霉HY5中獲得3對(duì)azaphilones類(lèi)同分異構(gòu)體化合物，對(duì)反枝莧胚根和胚芽的抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性藥，對(duì)苘麻幼苗生長(zhǎng)也有一定抑制作用[28]。本研究所使用的海洋雜色曲霉D5發(fā)酵提取物在盆栽試驗(yàn)中對(duì)雙子葉雜草具有明顯的除草活性，其活性成分ST和DHST能夠明顯抑制反枝莧、刺莧、綠莧等雜草的生長(zhǎng)，活性?xún)?yōu)于對(duì)照藥劑草甘膦。在本研究中，又進(jìn)一步將含ST和DHST的D5發(fā)酵提取物進(jìn)行田間除草試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)低施藥量（675 g/hm2）下，提取物對(duì)艾（）、毛茛（）、婆婆納（）和打碗花（）等雙子葉雜草均具有抑制效果，其中對(duì)婆婆納和打碗花的鮮質(zhì)量防效均達(dá)到50%以上，同時(shí)，對(duì)禾本科的狗尾草也具有一定的防治效果，表明D5提取物具有開(kāi)發(fā)成為天然產(chǎn)物除草劑的潛力。

Xanthones類(lèi)化合物已被報(bào)道具有多種生物活性[29-30]，如抗菌、殺蟲(chóng)、抗病毒等，但近十年國(guó)內(nèi)外關(guān)于此類(lèi)化合物除草活性的文獻(xiàn)報(bào)道僅有1篇且除草活性較弱[31]。本研究開(kāi)發(fā)的天然產(chǎn)物除草劑D5提取物主要活性成分為ST和DHST，是目前報(bào)道的除草活性最強(qiáng)的xanthones類(lèi)化合物。后續(xù)，可通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的方法進(jìn)一步提高該類(lèi)化合物的活性，并降低毒性。

4 結(jié) 論

結(jié)果表明，貴州遵義道真煙田優(yōu)勢(shì)雜草為莧，相對(duì)多度值高達(dá)84.2；余慶煙田優(yōu)勢(shì)雜草為蓼，危害級(jí)別達(dá)到Ⅲ級(jí)；兩地優(yōu)勢(shì)雜草均為雙子葉雜草。對(duì)前期篩選獲得的對(duì)雙子葉雜草具有明顯除草活性的海洋雜色曲霉D5進(jìn)行發(fā)酵和活性組分提取，在保證提取效率和成本的基礎(chǔ)上，使活性成分含量達(dá)到15%；進(jìn)一步在遵義煙區(qū)進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)表明，D5發(fā)酵提取物對(duì)菊科艾、玄參科婆婆納、毛茛科毛茛、旋花科打碗花等雙子葉雜草有不同程度的抑制作用，尤其對(duì)婆婆納作用顯著，鮮質(zhì)量防效達(dá)61.4%。同時(shí)，對(duì)禾本科狗尾草也有明顯的除草效果。本研究為開(kāi)發(fā)新型天然產(chǎn)物除草劑提供了新的資源和理論基礎(chǔ)。

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Weed Investigation in Zunyi Tobacco Areas and Study on Herbicidal Effects of MarineExtract

WANG Mei1, WANG Xianbo2, MA Siqi1, PENG Zhixin1, LIU Rongxin1, ZHANG Chengsheng1, WAN Jun2, WEN Mingxia2, WU Huizi2, ZHU Qianxiang2, HAN Xiaobin2*, ZHAO Donglin1*

(1. Institute of Tobacco Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Zunyi Tobacco Branch Company, Zunyi, Guizhou 563000, China)

In order to develop new, safe and efficient natural product herbicides, the weed harm in tobacco fields were investigated by the inverted "W" nine-point sampling method and by the three-layer and three-level visual observation method in Daozhen County and Yuqing County, Zunyi City, Guizhou Province, to clarify the dominant weed species and control needs.D5, which had significant herbicidal activity against dicotyledonous weeds in indoor pot experiments, was fermentated and extracted, and the active ingredients and contents were clarified. Then the herbicidal effect of D5 fermented extract was evaluated by stem and leaf spraying in the field. The results showed that: (1) There were 15 species of weeds belonging to 9 families in Daozhen tobacco fields. Dicotyledonous Asteraceae was the most diverse family, and Amaranthaceae was the dominant family as it had the highest relative abundance value of 84.2% in total weeds. A total of 39 weeds in 16 families occurred in Yuqing tobacco fields. There were 29 species, 9 species, and 1 species of weeds with hazard grade Ⅰ, Ⅱ and Ⅲrespectively. The dicotyledonous Polygonumwas classified as hazard grade III. (2) MarineD5 fermented extract was eluted with 10% ethyl acetate-petroleum ether and then eluted with 100% ethyl acetate. There was basically no loss of active substances after concentration, including ST (14.6%) and DHST (0.4%). (3) Field trials found that, at a low dosage (675 g/ha), the fermented extract of D5 had a significant herbicidal effect, especially on dicotyledonous weeds, especially on, with the fresh mass control effect of 61.4%. Meanwhile, the fresh mass control effect againstandalso reached more than 50%. Therefore, the fermentation extract of D5 has a broad anti-weed spectrum and significant herbicidal effect on dicotyledonous weeds, and has the potential to be developed into a new natural product herbicide.

tobacco; weed investigation; natural product herbicides;; secondary metabolites

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.009

S435.72

A

1007-5119（2022）04-0062-08

中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目（2021XM10）；貴州省煙草公司遵義市公司科技項(xiàng)目（2018-03）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（1610232021007）

王 美（1989-），女，助理研究員，碩士，主要從事海洋微生物農(nóng)用活性物質(zhì)研究。E-mail：caoyuxiaowu@163.com

，E-mail：韓小斌，hanxiaobin2011@163.com；趙棟霖，zhaodonglin@caas.cn

2022-03-07

2022-07-15