橙皮素對(duì)煙草青枯病的誘導(dǎo)抗性研究

余 峰，李 潔，黎妍妍，李錫宏，鄭 露，彭五星，黃俊斌

橙皮素對(duì)煙草青枯病的誘導(dǎo)抗性研究

余 峰1，李 潔1，黎妍妍2*，李錫宏2，鄭 露1，彭五星3，黃俊斌1

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430207；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030；3.湖北煙草公司恩施州公司宣恩縣煙葉分公司，湖北 宣恩 445504）

為探究類黃酮誘導(dǎo)煙草抗青枯病的生理機(jī)制，從12種類黃酮化合物中篩選出對(duì)煙草青枯病防治效果最好的橙皮素，并對(duì)橙皮素處理后煙草葉片過(guò)氧化氫沉積、防御酶活性以及相關(guān)基因的表達(dá)量等進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，1 mmol/L橙皮素對(duì)青枯菌無(wú)直接的抑菌作用，但對(duì)青枯病具有較明顯的防控效果。橙皮素灌根處理誘發(fā)接種青枯菌煙草葉片過(guò)氧化氫的積累，顯著提高葉片過(guò)氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性以及煙株次生代謝產(chǎn)物中酚類和類黃酮含量，上調(diào)表達(dá)、、抗性基因，從而提高煙株對(duì)青枯病的抗性。由此可知，橙皮素可作為誘抗劑有效防控青枯病的發(fā)生。

類黃酮；誘導(dǎo)抗性；橙皮素；煙草青枯病

煙草青枯病是煙草上發(fā)生的一種重要的細(xì)菌性土傳病害，由青枯雷爾氏菌（）侵染引起。該病害屬于典型的系統(tǒng)性維管束病害，往往表現(xiàn)為“半邊瘋”癥狀，引起煙株萎蔫死亡。煙草青枯病在我國(guó)多個(gè)煙區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重危害煙葉的產(chǎn)量與品質(zhì)[1-2]。因此提高煙草對(duì)青枯病的抗性是目前亟待解決的問(wèn)題。

誘導(dǎo)抗性（Induced resistance，IR）是當(dāng)前有效的植物抗病策略，通過(guò)增強(qiáng)植物抗逆性與抗病潛力，使植物對(duì)病原菌產(chǎn)生持續(xù)、廣譜抗性[3]。目前，已有少數(shù)誘抗劑被報(bào)道，包括殼聚糖（CTS）、茉莉酸甲酯（MJ）、氨基寡糖素、納米NANO ZnO、礦質(zhì)元素（Si）等[4]。江厚龍等[5]發(fā)現(xiàn)外源水楊酸（SA）、核黃素、草酸可以提高葉片內(nèi)防御酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性及可溶性蛋白的含量，并在處理后第5天對(duì)煙草青枯病的平均防效達(dá)50%。李盼盼等[6]通過(guò)葉面噴施硅和苯并噻二唑（BTH）激活煙草防御酶活性，顯著提高和基因表達(dá)量。趙世元等[7]揭示黃腐酸可誘導(dǎo)煙草SA途徑PR基因和ET通路的基因以及泛素連接酶基因的過(guò)表達(dá)，從而提升煙草對(duì)青枯病抗性。目前，青枯病誘抗劑主要為人工合成的非植物源化合物，本研究則意在探討天然植物代謝物類黃酮作為誘抗劑來(lái)誘導(dǎo)煙草對(duì)青枯病的抗性。

類黃酮是廣泛分布于植物中的重要次生代謝產(chǎn)物，參與調(diào)節(jié)植物激素的信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白激酶活性等生理生化過(guò)程，引起植株的系統(tǒng)性防御[8]。例如，柚皮素能誘發(fā)擬南芥活性氧（ROS）迸發(fā)并影響MPK3和MPK6抗病途徑，促進(jìn)水楊酸積累，從而抑制丁香假單胞桿菌在擬南芥的侵染[9]。槲皮素、蘆丁通過(guò)灌根和噴霧影響煙草團(tuán)棵期根系的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)提升煙草青枯病的田間防效[10]。然而，目前黃酮類誘抗劑誘導(dǎo)植物抗病機(jī)制并未明確，因此本研究選取了黃酮類化合物中具有典型特征的12種化合物并測(cè)定其誘抗作用，篩選出橙皮素對(duì)煙草青枯病的防效最好，并進(jìn)一步明確了橙皮素在促進(jìn)煙株過(guò)氧化氫沉積、防御酶活性、總酚和類黃酮含量及防御相關(guān)基因表達(dá)中的作用，旨在闡明類黃酮對(duì)煙草青枯病的抗病機(jī)理，為生物源農(nóng)藥開(kāi)發(fā)和煙草青枯病綠色防控提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究篩選所用的類黃酮化合物共12種，包括黃酮類、黃烷酮類、黃酮醇類、黃烷醇類、異黃酮類、花青素類和二氫黃酮類。具體類別、通用名及生產(chǎn)廠家詳見(jiàn)表1。

表1 供試類黃酮化合物

試驗(yàn)于2020年在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；供試青枯雷爾氏菌株HB-XF-1（），煙草品種云煙87，由湖北省煙草科學(xué)研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 不同類黃酮物質(zhì)對(duì)煙草青枯菌的抑制效果測(cè)定 采用牛津杯法測(cè)定類黃酮對(duì)煙草青枯病的抑菌活性。參考張欣悅等[11]的方法制備含煙草青枯菌的培養(yǎng)基，將滅菌的牛津杯（直徑6 mm）平鋪在培養(yǎng)基上，依次向圓孔中注入50 μL濃度分別為1、4、8 mmol/L的類黃酮物質(zhì)母液，以滅菌二甲基亞砜（DMSO）作為空白對(duì)照，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，72 h后采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.2 不同類黃酮物質(zhì)對(duì)煙草青枯病的誘抗作用及防效測(cè)定 待煙草長(zhǎng)至五葉一心期，將1、4、8 mmol/L的12種類黃酮溶液和清水（CK）分別采用灌根的方式處理煙株，每株10 mL。24 h后采用刺莖接種法將1×108CFU/mL（600=0.2）的青枯菌HB-XF-1菌懸液接種于煙草莖基部，并用棉球保濕，將煙苗置于26 ℃、光照周期為14 h光照/10 h黑暗的人工氣候箱中。共13個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每重復(fù)15株煙苗。接種15 d后按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/23222—2008[12]調(diào)查煙株發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.2.3 橙皮素誘導(dǎo)煙株抗性的機(jī)理研究 試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，T1（橙皮素+Rs）：橙皮素（濃度1 mmol/L，10 mL/株）溶液灌根處理五葉一心期的煙草24 h后，采用刺莖接種法接種青枯菌（1×108CFU/mL，10 mL/株）；T2（BTH+Rs）：BTH（1 mmol/L，10 mL/株）溶液灌根處理五葉一心期的煙草24 h后，接種青枯菌（1×108CFU/mL，10 mL/株）；T3（Rs對(duì)照）：清水（10 mL/株）灌根處理五葉一心期的煙草24 h后，接種青枯菌（1×108CFU/mL，10 mL/株）；CK（清水對(duì)照）：清水（10 mL/株）灌根。每個(gè)處理3次重復(fù)，每重復(fù)15株煙苗。

（1）DAB染色法檢測(cè)過(guò)氧化氫的沉積：T1、T2和T3分別于青枯菌接種后12、24、48、72 h取樣，CK于同一時(shí)期進(jìn)行取樣。采用1 mg/mL DAB染色液在黑暗條件下染色煙草葉片8 h，然后將染色葉片進(jìn)行漂洗、脫色后觀察拍照，通過(guò)Image J軟件對(duì)染色葉片定量測(cè)定染色強(qiáng)度[13]。

（2）抗性酶活性和酚類代謝物含量測(cè)定：T1、T2和T3分別于青枯菌接種后2、12、24、48、72 h取煙株同一部位剪取葉片，CK于同一時(shí)期進(jìn)行取樣，樣品一部分保存至?20 ℃，按照愈創(chuàng)木酚法[14]測(cè)定POD活性，高俊鳳等[15]的方法測(cè)定PAL活性，郭默然等[16]的方法測(cè)定煙草總酚及類黃酮含量。

（3）防御相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定：T1、T2和T3分別于青枯菌接種后2、24、48 h取煙草根部樣品，CK同期取樣，迅速用液氮保存。用TRIzol方法提取總RNA，cDNA合成使用北京全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，擴(kuò)增體系為30 μL：15 μL Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 μL引物（2 μmol/L）、10 μL DNA（1 ng/μL）模板和2 μL H2O。熒光定量PCR（CFX96TM Real Time PCR system）反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s（40個(gè)循環(huán)）。擴(kuò)增結(jié)束后，使用2?ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件上，采用Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（=0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 不同類黃酮物質(zhì)對(duì)煙草青枯菌的抑菌作用

在平板上測(cè)定了12種類黃酮物質(zhì)在不同濃度下對(duì)煙草青枯菌的抑菌活性。結(jié)果表明（表2），黃岑素表現(xiàn)出最高的抑菌活性，1 mmol/L、4 mmol/L黃岑素的抑菌圈直徑均顯著高于同濃度下的其他處理。與對(duì)照相比，黃酮、柚皮素、橙皮素、槲皮素在1 mmol/L濃度下對(duì)青枯菌無(wú)顯著抑菌效果，但隨著濃度的升高抑菌活性逐漸增強(qiáng)，而原花青素、蘆丁、兒茶素在不同濃度下對(duì)青枯菌均無(wú)抑菌效果。

表2 不同類黃酮對(duì)煙草青枯菌的抑制作用

注：同列小寫(xiě)字母不同表示在0.05水平上差異顯著(=0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicated significant differences at the level of 0.05 (=0.05). The same below.

2.2 不同類黃酮物質(zhì)對(duì)煙草青枯病的室內(nèi)盆栽防效

室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），1 mmol/L的類黃酮中，橙皮素、川陳皮素和黃酮對(duì)煙草青枯病的防效最好。4 mmol/L濃度下，除葛根素和黃豆黃素外，其他類黃酮的防效均有不同程度下降；8 mmol/L濃度下，黃酮、槲皮素、川陳皮素、兒茶素、原花青素、黃岑素對(duì)煙草具有毒害作用。

表3 不同濃度類黃酮灌根處理對(duì)煙草青枯病的防效

注：T代表產(chǎn)生毒害。Note: T stands for phytotoxicity.

綜上所述，與中高濃度（4 mmol/L、8 mmol/L）相比，低濃度類黃酮（1 mmol/L）對(duì)青枯菌的抑菌活性較低，但對(duì)煙草青枯病具有較好的防效，其中尤以橙皮素防效顯著，因此選取橙皮素開(kāi)展了后續(xù)抗病機(jī)理研究。

2.3 橙皮素處理對(duì)煙草過(guò)氧化氫沉積的影響

通過(guò)DAB染色法測(cè)定了不同處理煙草葉片中過(guò)氧化氫的沉積情況。結(jié)果表明，在清水對(duì)照組中，葉片基本無(wú)黃褐色沉淀，而在橙皮素+Rs處理中，青枯菌接種12 h后煙草葉片開(kāi)始出現(xiàn)明顯的H2O2沉積，并在24 h達(dá)到最高后逐漸減弱（圖1）。對(duì)DAB染色的煙葉進(jìn)行了定量測(cè)定，結(jié)果表明，橙皮素+Rs處理染色強(qiáng)度呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，接種24 h葉片中H2O2的積累量分別是Rs對(duì)照和清水對(duì)照的2.3倍和5.3倍，三者間具有顯著差異，在24 h和48 h煙草葉片H2O2積累量顯著高于BTH+Rs處理（圖2）。以上結(jié)果表明煙草受到橙皮素誘導(dǎo)可促進(jìn)過(guò)氧化氫的沉積。

2.4 橙皮素處理對(duì)煙草防御酶活性及酚類代謝物含量的影響

由圖3可知，各處理葉片PAL活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在青枯菌接種48 h時(shí)達(dá)到峰值。與Rs對(duì)照相比，橙皮素+Rs處理可顯著提高煙草體內(nèi)PAL活性，在青枯菌接種2 h后葉片PAL活性顯著高于Rs對(duì)照，接種48 h時(shí)達(dá)到Rs對(duì)照的1.99倍，且顯著高于其他處理；與BTH+Rs處理相比，橙皮素+Rs處理在青枯菌接種12～72 h間葉片PAL活性增高1.50%～68.22%。橙皮素+Rs處理后POD活性呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，在青枯菌接種24 h最高，比Rs對(duì)照高2.01倍，且在青枯菌接種72 h時(shí)仍維持較高活性；與BTH+Rs處理相比，橙皮素+Rs處理在青枯菌接種2～72 h葉片POD活性增高11.37%～35.05%。

圖1 DAB染色法檢測(cè)煙草葉片中過(guò)氧化氫的沉積

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（Duncan新復(fù)極差式，p=0.05）。

注：PAL，每克鮮樣在每毫升反應(yīng)體系中每分鐘使A290變化 0.1 為1個(gè)PAL酶活力單位(1 U)；POD，每克組織在每毫升反應(yīng)體系中每分鐘使A470變化0.01為一個(gè)POD酶活力單位(1 U)。

由圖4可知，各處理葉片總酚含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，其中橙皮素+Rs處理的葉片總酚含量在青枯菌接種72 h時(shí)達(dá)到最高值，為Rs對(duì)照的1.4倍，顯著高于其他處理；與BTH+Rs處理相比，橙皮素+Rs處理在青枯菌接種2 ～72 h間葉片酚類化合物增高1.00%～22.73%。橙皮素+Rs和BTH+Rs處理后葉片黃酮類化合物含量先下降后迅速上升，且前者始終顯著高于后者。由此可知，橙皮素灌根可顯著提高煙草葉片中總酚和黃酮類化合物的含量。

圖4 橙皮素誘導(dǎo)對(duì)煙草葉片酚類代謝物的影響

2.5 橙皮素處理對(duì)煙草防御相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖5可知，橙皮素+Rs處理后苯丙氨酸解氨酶相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)，是BTH+Rs處理的1.23～3.49倍、Rs對(duì)照的1.59～3.26倍；水楊酸途徑相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于其他處理，是BTH+Rs處理的1.53～20.32倍、Rs對(duì)照的2.16～13.49倍。青枯菌接種2 h和24 h時(shí)，橙皮素+Rs處理煙草基因的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于其他處理，是Rs處理的1.52倍和2.37倍、BTH+Rs處理的1.74倍和2.35倍。乙烯信號(hào)途徑的基因表達(dá)水平變化較小。因此，橙皮素灌根處理可提高煙草植株中水楊酸途徑、苯丙氨酸酶途徑相關(guān)防御基因表達(dá)，而對(duì)乙烯代謝途徑影響較小。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素在1 mmol/L時(shí)對(duì)青枯菌無(wú)明顯的抑菌效果，卻顯著提高了煙草對(duì)青枯病的抗性，然而當(dāng)濃度高于4 mmol/L時(shí)削弱了煙草抗性甚至產(chǎn)生毒害作用。這與趙瀟璨等[17]研究一致，誘抗劑濃度與植物誘抗作用并不呈正比，濃度過(guò)高或過(guò)低誘抗作用均不能最大程度發(fā)揮作用，只有在一定范圍內(nèi)才能誘導(dǎo)植物抗病性。探其原因，一方面可能是橙皮素作為可滲透細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)影響了植物體的吸收和利用；另一方面是其誘抗作用的細(xì)胞靶點(diǎn)仍未確定，過(guò)高濃度可能誘導(dǎo)了程序性細(xì)胞死亡[18]。以上結(jié)果說(shuō)明，橙皮素誘導(dǎo)后引發(fā)煙草免疫應(yīng)答，產(chǎn)生系統(tǒng)抗性而提高煙株對(duì)青枯病抗性的適宜濃度為1mmol/L。

在介導(dǎo)系統(tǒng)性防御的反應(yīng)中，H2O2被認(rèn)為是激活抗病性的信號(hào)分子，經(jīng)誘導(dǎo)后可迅速積累并引發(fā)活性氧的迸發(fā)[19]。研究發(fā)現(xiàn)DAB染色劑與H2O2反應(yīng)會(huì)生成紅褐色沉淀，因此，通過(guò)測(cè)定葉片染色強(qiáng)度可反映出活性氧迸發(fā)水平[20]。H2O2在質(zhì)外體激活ROS傳感器并誘導(dǎo)Ca2+流入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致全身信號(hào)的傳遞[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素灌根處理24 h后煙草葉片中的H2O2積累量顯著升高，表明橙皮素引起了防御過(guò)程的早期反應(yīng)，引起活性氧迸發(fā)并將誘導(dǎo)信號(hào)傳遞到葉片。

圖5 橙皮素灌根處理對(duì)煙草防御基因表達(dá)的影響

在寄主與病原菌長(zhǎng)期互作進(jìn)化過(guò)程中，防御酶與生理代謝水平的變化與植株抗病性密切聯(lián)系[22]。POD的活性影響木質(zhì)素和植保素的合成；PAL在苯丙烷代謝途徑中起到關(guān)鍵作用，是酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶[23]。本研究發(fā)現(xiàn)在類黃酮灌根處理的初期，POD和PAL活性均維持在較高水平，這表明類黃酮能提高防御酶活性，可提高酚類物質(zhì)含量，有助于角質(zhì)層形成和加厚細(xì)胞壁，從而提高煙株對(duì)青枯菌入侵的抵抗能力。

植物受誘抗劑誘導(dǎo)后，PR基因被激活，通過(guò)水楊酸等激活HR反應(yīng)以及JA、ET等抗病過(guò)程抑制青枯病的發(fā)生[24]。PAL廣泛參與植物應(yīng)激反應(yīng)，可將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，這是水楊酸合成的關(guān)鍵過(guò)程[25]。本研究發(fā)現(xiàn)橙皮素誘導(dǎo)后基因在2 h出現(xiàn)短暫的上調(diào)表達(dá)，這可能由于在橙皮素誘導(dǎo)一段時(shí)間后，乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑減弱，在誘導(dǎo)青枯病系統(tǒng)抗性中水楊酸信號(hào)途徑在防御反應(yīng)占據(jù)主導(dǎo)地位。SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的和是SAR建立的標(biāo)志蛋白，PAL能進(jìn)一步促進(jìn)水楊酸的合成，這與橙皮素誘導(dǎo)處理后、基因和在2 h至48 h內(nèi)顯著上調(diào)表達(dá)結(jié)果一致，揭示了橙皮素誘導(dǎo)煙草青枯病抗性依賴SA途徑，這是因?yàn)橄到y(tǒng)誘導(dǎo)SAR需要SA的積累[26]。

本研究明確了類黃酮化合物可作為青枯病誘抗劑誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)性抗性，然而對(duì)田間發(fā)生較為嚴(yán)重的黑脛病、根腐病等煙草病害是否具有廣譜抗性還有待研究。

4 結(jié) 論

研究了12種類黃酮對(duì)煙草青枯病的誘抗作用，篩選出1 mmol/L濃度的橙皮素灌根對(duì)煙草青枯病具有良好的防控效果，顯著提升葉片中PAL、POD活性與次生代謝產(chǎn)物中酚類和類黃酮含量，誘發(fā)過(guò)氧化氫的沉積，同時(shí)提高水楊酸途徑（和）、苯丙氨酸酶途徑（）相關(guān)防御基因表達(dá)水平。表明類黃酮化合物中橙皮素可誘導(dǎo)青枯病的抗性，對(duì)煙草青枯病綠色防控具有重要指導(dǎo)意義。

[1] 黎妍妍，王林，孫光偉，等. 清江流域煙區(qū)煙草青枯病流行時(shí)間動(dòng)態(tài)及氣象因素分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2017，23（4）：77-83.

LI Y Y, WANG L, SUN G W, et al. Jemporal epidemic dynamics and climatic factors of transmission of tobacco bacterial wilt in Qingjiang river basin[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(4): 77-83.

[2] 劉艷瀟，祝一鳴，周而勛. 植物免疫誘抗劑的作用機(jī)理和應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種，2020，18（3）：1020-1026.

LIU Y X, ZHU Y M, ZHOU E X. Research progress on the action mechanism and application of plant immune inducers[J]. Molecular Plant Breeding, 2020, 18(3): 1020-1026.

[3] KESEL J D, CONRATH U, FLORS V, et al. The induced resistancelexicon: Do's and Don'ts[J]. Trends In Plant Science, 2021, 26(7): 685-691.

[4] 薛梅，曾婉琳，張榮，等. 防控?zé)煵萸嗫莶≈参锩庖哒T抗劑的篩選及其防治效果測(cè)定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，48（6）：87-92.

XUE M, ZENG W L, ZHANG R, et al. Screening of plant immune inducer against tobacco bacterial wilt and determination of its control effect[J]. Guangdong Agricultural Sciences, 2021, 48(6): 87-92.

[5] 江厚龍，李鵬，李鈉鉀，等. 外源誘抗劑對(duì)煙草青枯病的誘抗效果研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（28）：286-290.

JIANG H L, LI P, LI N J, et al. Inhibition effects of induced resistance on tobacco resistance to[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2014, 30(28): 286-290.

[6] 李盼盼. 苯并噻二唑(BTH)和硅(Si)誘導(dǎo)煙草抗青枯病機(jī)理的研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2016.

LI P P. Comparative research on silicon and BTH-Induced tobacco resistant to tobacco bacterial wilt[D]. Chongqing: Southwest University, 2016.

[7] 趙世元. 黃腐酸誘導(dǎo)煙草抗青枯病的活性及初步機(jī)理研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2020.

ZHAO S Y. Research on preliminary mechanism of resistance to tobacco bacterial wilt induced by fulvic acid[D]. Chongqing: Southwest University, 2020.

[8] ZHANG G, LI J, LI W, et al. Metabolism and regulation mechanisms of flavonoids in tobacco[J]. Genomics And Applied Biology, 2017, 36(4): 1672-1681.

[9] AN J, KIM S H, BAHK S, et al. Naringenin induces pathogen resistance against pseudomonas syringae through the activation of NPR1 in[J]. Frontiers In Plant Science, 2021, 12: 672552.

[10] 趙世元，魏康凱，何孝兵，等. 黃酮類化合物對(duì)煙草青枯病的田間防控效果研究[J]. 植物醫(yī)生，2019，32（1）：9-13.

ZHAO S Y, WEI K K, HE X B, et al. Field control effects of flavonoids for bacterial wilt[J]. Plant Doctor, 2019, 32(1): 9-13.

[11] 張欣悅，羅翠琴，陳小潔，等. 兩株防治煙草青枯病的煙草根際拮抗菌[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2020，26（1）：91-99.

ZHANG X Y, LUO C Q, CHEN X J, et al. Evaluation of two antagonistic bacteria from tobacco rhizosphere for contobacco bacterial wilt [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2020, 26(1): 91-99.

[12] 國(guó)家煙草專賣局. GB/T23222—2008 煙草病蟲(chóng)害分級(jí)調(diào)查方法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

State Tobacco Monopoly Administration. GB/T23222—2008 Grade and investigation method of tobacco diseases and insect pests[S]. Beijing: Standards Press of China, 2008.

[13] 梁穎博. Nbnrp1蛋白介導(dǎo)大麗輪枝菌激發(fā)子PevD1誘導(dǎo)本生煙抗病性的分子機(jī)制[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2019.

LIANG Y B. Molecular mechanisms of Nbnrp1 mediated verticillium dahliae elicitor PevD1-induced disease resistance in[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2019.

[14] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

LI H S. Principles and techniques of plant physiology and biochemistry experiments[M]. Beijing: Higher Education Press, 2000.

[15] 高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

GAO J F. Instructions for plant physiology experiments [M]. Beijing: Higher Education Press, 2006.

[16] 郭默然. 牛蒡低聚果糖誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)抗性的表達(dá)譜分析及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2014.

GUO M R. Transcriptome profile analysis and signal transduction of resistance induced by burdock fructooligosaccharide in tobacco[D]. Jinan: Shandong University, 2014.

[17] 趙瀟璨，徐永清，賀付蒙，等. 低濃度嘔吐毒素作為激發(fā)子對(duì)馬鈴薯抗干腐病的誘導(dǎo)及其作用機(jī)制[J]. 作物學(xué)報(bào)，2020，46（11）：1801-1809.

ZHAO X C, XU Y Q, HE F M, et al. Low concentration of vomitoxin as elicitor induced resistance of dry rot disease of potato and its mechanism[J]. Acta Agronomica Sinica, 2020, 46(11): 1801-1809.

[18] JAMIOLKOWSKA A. Natural compounds as elicitors of plant resistance against diseases and new biocontrol strategies[J]. Agronomy, 2020, 10(2): 173-184.

[19] CASTRO B, CITTERICO M, KIMURA S, et al. Stress-induced reactive oxygen species compartmentalization, perception and signaling[J]. Nature Plants, 2021, 7(4): 403-412.

[20] 崔仕春，唐小麗，邱德文，等. 互作蛋白Nbnrp1參與真菌蛋白激發(fā)子PevD1誘導(dǎo)煙草抗病性的功能研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2017，47（1）：92-100.

CUI S C, TANG X L, QIU D W, et al. Function of a binding protein Nbnrp1 in fungal elicitor PevD1 induced resistance in[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2017, 47(1): 92-100.

[21] ALTINOK H H, YILDIZ H N, DIKILITAS M. Induced systemic resistance against fusariun wilt of tomato by rhizobacterial isolates [J]. Fresenius Environmental Bulletin, 2020, 29(1): 393-401.

[22] 曹景林，孫藝文. 植物與青枯病互作研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)研究，2021，10（3）：216-224.

CAO J L, SUN Y W. Research progress in the interaction between plant and bacterial wilt[J]. Botanical Research, 2021, 10(3): 216-224.

[23] 郝向陽(yáng)，孫雪麗，王天池，等. 植物PAL基因及其編碼蛋白的特征與功能研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（7）：1452-1461.

HAO X Y, SUN X L, WANG T C, et al. Characteristics and functions of plant phenylalanine ammonia lyase genes and the encoded proteins [J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2018, 39(7): 1452-1461.

[24] LIU Y, LIU Q, TANG Y, et al. NtPR1a regulates resistance toinvia activating the defense-related genes[J]. Biochemical And Biophysical Research Communications, 2019, 508(3): 940-945.

[25] LEFEVERE H, BAUTERS L, GHEYSEN G. Salicylic acid biosynthesis in plants [J]. Frontiers In Plant Science, 2020, 11: 338.

[26] 黃子凌，李大勇，宋鳳鳴. 植物系統(tǒng)獲得抗性中的系統(tǒng)信號(hào)及其作用機(jī)制[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2020，56（7）：1346-1360.

HUANG Z L, LI D Y, SONG F M. Systemic signals and their mechanisms in mechanisms in plant systemic acquired resistance[J]. Plant Physiology Journal 2020, 56(7): 1346-1360.

Study on the Effect of Hesperetin on the Induction of Tobacco Resistance to Bacterial Wilt

YU Feng1, LI Jie1, LI Yanyan2*, LI Xihong2, ZHENG Lu1, PENG Wuxing3, HUANG Junbin1

(1. College of Plant Science and Technology, Huazhong Agriculture University, Wuhan 430207, China; 2. Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, China; 3. Xuan’en Branch Company of Enshi Tobacco Corporation, Xuan’en, Hubei 445504, China)

In order to explore the mechanism of hesperetin inducing tobacco plants’ resistance to bacterial wilt, hesperetin with the best control effect against tobacco bacterial wilt was screened from 12 flavonoids, and the accumulation of H2O2, the activities of leaf defense enzymes, and the expression of genes related to disease resistance were analyzed and determined. The results showed that hesperetin had no antibacterial effect at a low concentration of 1 mmol/L, but had obvious effect on inducing tobacco plants’ resistance to bacterial wilt. Hesperetin irrigation caused H2O2deposition, significantly increased the activities of peroxidase (POD), phenylalanine lyase (PAL) and the content of secondary metabolites phenols and flavonoids. In addition,the expression of resistance genes, andwas up-regulated, thereby improving the resistance of tobacco plants to bacterial wilt. Therefore, hesperetin could be used as bacterial wilt inducers to effectively control the occurrence of bacterial wilt.

flavonoids; induced resistance; hesperetin; tobacco bacterial wilt

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.008

S435.72

A

1007-5119（2022）04-0055-07

湖北省煙草公司科技項(xiàng)目（027Y2020-002）；中國(guó)煙草總公司重大科技項(xiàng)目[110202101045（LS-05）]

余 峰（1995-），碩士研究生，主要從事煙草細(xì)菌性病害研究。E-mail：519773188@qq.com。*通信作者，E-mail：yanyanli0025@126.com

2021-12-22

2022-06-07