干旱脅迫對赤芍生理特性影響及相關(guān)基因的克隆表達

王丹丹，王 鵬，韓智陽,劉丹梅

(遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118000)

赤芍(RadixpaeoniaeRubra)，又名毛果赤芍、木芍藥或紅芍藥，隸屬于毛莨科(Ranunculaceae)芍藥(PaeonialactifloraPall)或川赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)，為多年生草本植物，外表黑褐色無毛，根肥大、紡錘形或圓柱形；味苦、性微寒，歸肝、脾經(jīng)，有清熱涼血、活血祛瘀的功效。赤芍為我國傳統(tǒng)名花，素有“花相”的美譽，因其花型多樣、花色多彩及氣質(zhì)典雅而有較高的園林觀賞價值，廣泛用于園林造景；主要分布于東北、華北、陜西及甘肅等地。赤芍喜光、濕潤之地，對水分缺乏較敏感，而北方地區(qū)為赤芍主產(chǎn)區(qū)，多為干旱或半干旱地區(qū)，春季干燥、降水少，夏季炎熱、干旱少雨造成水資源短缺，顯著影響了赤芍的生長發(fā)育及產(chǎn)量[1]，可見，干旱是影響北方地區(qū)赤芍栽培的主要逆境脅迫因子[2]。

干旱抑制植物生長發(fā)育和細胞有絲分裂，降低細胞膨壓，減弱細胞伸長和擴張能力，導(dǎo)致植物生長速度降低、植株矮細小、抽芽量減少、葉片枯黃皺縮且表面積減小以及根系發(fā)育不良等不可逆的生理損傷[3]。根系是吸收水分的主要器官，干旱脅迫下根系首先接收水分虧缺信號，通過根系肉質(zhì)化、根皮變厚、增加側(cè)根數(shù)量及根向下深扎程度及提高根冠比廣泛吸收土壤深層水分等方式響應(yīng)干旱脅迫，之后信號傳遞到其他器官[4]；干旱脅迫會影響植物的滲透調(diào)節(jié)、營養(yǎng)代謝、呼吸作用與光合作用等，尤其是葉片形態(tài)及部分生理特性，如細胞壁變厚、葉片皺縮變小、氣孔下陷以及柵欄組織與海綿組織比值降低等；生殖階段干旱脅迫影響種子數(shù)量、大小和成分，而且花數(shù)、結(jié)莢率、結(jié)實率等指標均顯著下降，嚴重影響植株生殖。此外，植物體內(nèi)很多基因直接參與對干旱脅迫的抵御，通過該類基因的表達調(diào)控減緩脅迫傷害以維持細胞的正常生理代謝，主要包括編碼脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(DREB)、MYB轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、抗氧化酶、滲透調(diào)節(jié)因子合成酶以及保護細胞結(jié)構(gòu)的功能蛋白基因等[5-8]。

干旱脅迫是影響赤芍生長發(fā)育的主要逆境因子之一，涉及赤芍的每個生長發(fā)育階段，并在發(fā)育完成后會繼續(xù)影響赤芍的營養(yǎng)運輸、吸收、光合作用與呼吸作用等生理代謝過程。我國約50%的土地為干旱或半干旱地區(qū)，南方由于偶發(fā)雨量不均或時空分布等原因也會引發(fā)季節(jié)性干旱[9]。部分藥用植物在適度干旱脅迫下，不但能形成優(yōu)良理化性質(zhì)，還能固水防沙﹑保護生態(tài)，因此，探究藥用植物抗旱性對了解、保護干旱地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)和藥用植物資源具有實踐意義。目前全球水資源短缺，構(gòu)建節(jié)水型綠化園林以及培育耐旱赤芍栽培種已是大勢所趨[10]。有關(guān)赤芍干旱應(yīng)答的抗旱生理指標動態(tài)變化報道較少，且對抗旱相關(guān)基因的表達調(diào)控及赤芍抗旱機制的研究亦相對薄弱。因此，為了闡明赤芍抗旱機制，本研究探討了不同程度干旱脅迫下赤芍光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等生理指標，以及相關(guān)基因(DREB、Psb27、PsaK、MDHAR、SOD、GR)的表達特征，旨在為赤芍抗旱品種選育及其在干旱、半干旱地區(qū)的栽培實踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用盆栽控水法，2021年6月以5 a生赤芍盆栽苗(壤土∶粗砂∶泥炭=1∶1∶1)為試驗材料，處理前將赤芍澆透水，后分為3組：輕度干旱(土壤相對含水量約為田間持水量的50%)、重度干旱(土壤相對含水量約占田間持水量的15%)；對照組(土壤相對含水量約為田間持水量的80%)。土壤田間持水量測定采用環(huán)刀法。每24 h采用稱重法補充各盆栽的水分，盆栽混合土壤田間持水為100%時，土壤凈含水量約為70%。分別在處理后的第0、4、8、12、16、20、24天取樣檢測生理指標；選擇第15天的赤芍進行基因表達分析，每個試驗均做3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 生理指標檢測 采用烘干稱重法測定葉片相對含水量，取適量赤芍新鮮葉片，采用天平(0.0001 g, 美國OHAUS CP214)稱鮮質(zhì)量(FW)，100℃烘箱處理7 min，后65℃處理3 h，烘干直至恒重記為干質(zhì)量(DW)，葉片相對含水量(%)=(FW-DW)/FW×100%?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍讬z測分別采用可溶性糖試劑盒與可溶性蛋白試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，中國)；每天上午9∶00采用便攜式光合熒光測量系統(tǒng)(LI-6800，LI-COR公司，美國)內(nèi)置光源(光照強度為1 500 μmol·m-2·s-1)對赤芍從下往上的第5片成熟葉片(每個處理采用相同部位葉片)測定光合速率(Pn)，蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)值；采用葉綠素試劑盒和胡蘿卜素試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)測定色素含量；采用植物激素脫落酸ELISA檢測試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)測定脫落酸(Abscisic acid，ABA)含量；采用磺基水楊酸法提取、測定赤芍葉片脯氨酸的含量[11-12]；采用硫代巴比妥酸(TAB)法提取、測定赤芍葉片丙二醛含量；采用GSH檢測試劑盒和AsA檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)測定AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)酶活性[13-14]，每個處理重復(fù)3次取平均值。

1.2.2RpDREB基因RACE克隆 以羅勒(OcimumbasilicumL.)ObDREB基因序列(GenBank：KR136344.1)設(shè)計引物(表1)。取赤芍根、葉組織液氮研磨，按RNA提取試劑盒(EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kit)說明書提取赤芍總RNA，采用分光光度計(UV 751GD)檢測其純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性；以赤芍總RNA為模板，按AMV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒(AMV first strand cDNA synthesis kit)合成赤芍cDNA第一鏈，-20℃保存用于后續(xù)RpDREB克隆模板。以赤芍cDNA第一鏈為模板，DREB-coreF/DREB-coreR為引物，克隆RpDREB核心序列[15]。反應(yīng)體系20 μL，包含1 μL cDNA，0.6 μL dNTP Mix，0.8 μL 10 μmol·L-1上下游引物，(10×)Advantage?PCR 緩沖液2.0 μL，(50×)Advantage?聚合酶混合液0.8 μL，加ddH2O 至20 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min；采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。采用DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒(DiaSpin DNA gel extraction kit)回收PCR產(chǎn)物，連接pGM-T vector載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將篩選的陽性克隆送至生工生物工程(上海)公司測序。采用5′-RACE 試劑盒和3′-RACE 試劑盒(SMARTer RACE cDNA amlification kit試劑盒)快速擴增克隆RpDREB核心序列的5′端和3′端，將獲得的5′端和3′端赤芍RpDREB片段電泳、切膠純化與測序，后采用DNAStar的SeqMan程序拼接5′-RACE、核心序列與3′-RACE序列，并以赤芍cDNA為模板，采用跨赤芍RpDREB基因開放閱讀框(ORF)的RpDREB-F/ RpDREB-R為引物，擴增RpDREB基因，并測序驗證是否與拼接序列一致。本研究共克隆6個赤芍干旱脅迫相關(guān)基因，以RpDREB克隆為例[16]。

1.2.3 基因表達分析 選擇赤芍干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白DREB，光合作用相關(guān)蛋白Psb27(光系統(tǒng)ⅡPsb27蛋白)和PsaK(光系統(tǒng)Ⅰ亞基X蛋白)，抗氧化響應(yīng)相關(guān)基因單脫氫抗壞血酸還原酶(Monodehydroascorbate reductase,MDHAR)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase, GR)進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測上述蛋白干旱脅迫下的表達情況(引物見表1)。25 μL qRT-PCR反應(yīng)體系，SYBRPremixExTaqⅡ(2×)5.5μL，10μmol·L-1上下游引物各1.5μL，ROX參比染料(50×)0.8 μL，cDNA模板1.8 μL，加ddH2O 至25 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性50 s，60℃退火45 s，72℃延伸50 s，40個循環(huán)；每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)取平均值，采用2-ΔΔCt法進行上述基因表達水平的分析計算[17]。

表1 引物信息

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel 2016和 DPS 7.05軟件進行試驗數(shù)據(jù)與差異顯著性分析，采用SPASS 21.0與SAS/STAT進行方差分析，采用Duncan多重極差法進行檢驗(P<0.05)[18]。所有試驗均采用完全隨機設(shè)計生物學(xué)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對赤芍葉片相對含水量的影響

葉片是對干旱脅迫反應(yīng)最敏感的器官(圖1)，輕度干旱與重度干旱脅迫4 d時赤芍葉片含水量保持一致，8 d后輕度干旱脅迫葉片含水量下降不明顯，而重度干旱植株葉片含水量繼續(xù)下降，12 d后，重度干旱植株葉片含水量顯著低于輕度干旱脅迫植株和對照組，到第24天時，重度干旱脅迫下赤芍葉片含水量不足20%，而輕度干旱和對照組葉片含水量均高于55%。

注：數(shù)值為均值±標準差(SD)，小寫字母表示同一時間不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Note: The values is mean ± standard deviation (SD), and lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the same time (P<0.05), the same below.

2.2 干旱脅迫對赤芍葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

可溶性糖與可溶性蛋白屬于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在持續(xù)干旱脅迫下，赤芍可通過提高二者含量來調(diào)控自身的含水量，達到維持植株正常生長發(fā)育的目的。結(jié)果顯示(圖2)，干旱脅迫促使赤芍葉片可溶性糖含量增加，重度干旱可溶性糖含量顯著高于輕度干旱和對照組，在第16天重度干旱可溶性糖含量顯著增加，而輕度干旱初期與對照組差異不顯著，第12天后顯著高于對照組；至干旱脅迫24 d，重度干旱和輕度干旱下赤芍葉片可溶性糖含量分別為對照的2.50倍和1.66倍。

圖2 干旱脅迫對赤芍葉片可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響Fig.2 Effects of drought stress on soluble sugar (A) and soluble protein (B) content of Radix paeoniae leaves

干旱脅迫下，赤芍葉片可溶性蛋白含量在干旱脅迫初期呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，而后逐漸下降，但重度干旱和輕度干旱可溶性蛋白的含量均高于同期對照組。重度干旱脅迫第16天時，赤芍葉片可溶性蛋白含量顯著上升達到峰值，為對照組的2.43倍，第20天時呈急劇下降趨勢，而輕度干旱與重度干旱曲線趨勢基本一致。

2.3 干旱脅迫對赤芍葉片光合參數(shù)的影響

與對照組相比，持續(xù)干旱脅迫抑制了赤芍葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)，3個指標隨脅迫時間的延長均呈下降趨勢(圖3)。輕度干旱脅迫下，赤芍葉片Pn、Tr和Gs均顯著高于重度干旱脅迫；重度干旱脅迫下，Pn、Tr和Gs在初期與輕度干旱無明顯差異，第8天后顯著下降，第16天后，上述3個指標均已趨近于零；而細胞間隙CO2濃度(Ci)變化趨勢與上述3項指標有顯著差異，輕度干旱初期Ci與重度干旱和對照組無明顯差異，第8天后逐漸上升，第12天下降，可能由于在第7天澆水的緣故，但Ci值始終低于重度干旱，而赤芍葉片在重度干旱下，其Ci值在第8天開始升高，在第12天呈直線上升趨勢，第20天時Ci值顯著高于輕度干旱脅迫(約2.21倍)和對照組(約2.76倍)。

圖3 干旱脅迫對赤芍葉片光合特性的影響Fig.3 Effects of drought stress on photosynthetic characteristics of Radix paeoniae leaves

2.4 干旱脅迫對赤芍葉片色素含量的影響

干旱脅迫對植物光合作用影響較大，由于干旱脅迫促使植物進行光合作用時葉片的氣孔導(dǎo)度(Gs)下降，CO2進入葉片受阻，致使光合效率下降，加之葉綠體中類囊體膜及其超微結(jié)構(gòu)均受損傷，最終致使赤芍光合色素合成亦發(fā)生改變。如圖4A所示，干旱脅迫條件下，赤芍葉片的葉綠素含量下降，明顯低于對照組，其中重度干旱脅迫下葉綠素含量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，第16天降低到最低值，約為對照組的26%，為輕度干旱的33%，而后呈上升趨勢；而干旱脅迫下，類胡蘿卜素與類黃酮的含量均有不同程度的升高(圖4B、圖4C)，且顯著高于對照組，其中重度干旱24 d時，赤芍葉片類胡蘿卜素與類黃酮的含量分別約為對照組的1.8倍和1.4倍，約為輕度干旱的1.4倍和1.2倍。

2.5 干旱脅迫對赤芍葉片脫落酸(ABA)含量的影響

如圖4D所示，持續(xù)干旱脅迫下，赤芍葉片ABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，第14天時ABA含量達到峰值，14～20 d緩慢下降，20～24 d呈劇烈下降趨勢，且略低于輕度干旱脅迫第24天的ABA含量；而輕度干旱脅迫下，赤芍葉片ABA含量初期與重度干旱與對照組無明顯差異，第8天后呈緩慢而穩(wěn)定上升趨勢，但始終高于對照組ABA含量。

圖4 干旱脅迫對赤芍葉片色素與ABA含量的影響Fig.4 Effects of drought stress on pigment and ABA content of Radix paeoniae leaves

2.6 干旱脅迫對赤芍根系脯氨酸與丙二醛含量的影響

脯氨酸(Pro)作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物抵御干旱脅迫過程中發(fā)揮重要作用，與植物的水分吸收密切相關(guān)，而丙二醛(MDA)是植物在逆境條件下發(fā)生膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，能夠反映細胞膜的過氧化程度大小與植物抗逆能力，如圖5所示，干旱脅迫下Pro和MDA在赤芍體內(nèi)會大量積累，呈穩(wěn)定上升趨勢，重度干旱第24天時，Pro含量分別為輕度干旱與對照組的1.34倍和1.19倍；而MDA含量在干旱脅迫第16天時劇烈上升，到第20天時，分別為輕度干旱和對照組的1.7倍和2.98倍。

圖5 干旱脅迫對赤芍根系脯氨酸與丙二醛含量的影響Fig.5 Effects of drought stress on proline and malonaldehyde content of Radix paeoniae roots

2.7 干旱脅迫對赤芍根系A(chǔ)sA和GSH含量的影響

AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)是植物體內(nèi)清除活性氧自由基(ROS)的主要途徑之一，逆境脅迫下，植物通過增加抗氧化劑含量和相關(guān)酶活性來提高AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的效率以抵御不良環(huán)境。由圖6可知，干旱脅迫下赤芍AsA和GSH 含量均呈先升后降趨勢，始終高于對照組。重度干旱脅迫第16天，抗壞血酸(AsA)含量達到峰值，分別是輕度干旱與對照組的1.14倍和1.21倍，而后AsA含量顯著下降，到第24天，約為對照組的1.11倍；與重度干旱相比，輕度干旱脅迫下，AsA變化相對較平緩(圖6A)。谷胱甘肽(GSH)在重度干旱脅迫下呈先上升后下降趨勢，但與AsA相比，GSH下降趨勢較為平緩，第16天達到峰值，分別為輕度干旱與對照組的1.41倍和1.61倍，到第24天，約為對照組的1.49倍；而輕度干旱脅迫下的GSH始終處于緩慢上升趨勢，到第24天，約為對照組的1.49倍(圖6B)。

2.8 赤芍RpDREB基因的克隆與編碼蛋白理化性質(zhì)

通過RT-PCR與RACE技術(shù)結(jié)合擴增赤芍RpDREB基因，cDNA全長1189 bp，編碼299個氨基酸(圖7)，采用Blastx比對赤芍此片段編碼的氨基酸，結(jié)果與較多植物DREBs基因具有較高的相似性，可達87%～98%，可見，試驗成功獲得赤芍DREB全長cDNA序列，即RpDREB基因。ProtParam預(yù)測RpDREB蛋白質(zhì)分子式為C1419H2208N384O427S12，分子量約33.86 kD，等電點7.64，不穩(wěn)定指數(shù)49.81，無信號肽，表明RpDREB為不穩(wěn)定的分泌蛋白質(zhì)。ProtScale分析RpDREB的平均親水性為-0.519，疏水性氨基酸少于親水性氨基酸，表明RpDREB蛋白為親水蛋白。SOPMA預(yù)測赤芍RpDREB蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)具有豐富的無規(guī)則卷曲(64.44%)、α-螺旋(22.54%)、延伸鏈(11.27%)和β-轉(zhuǎn)角(1.76%)。

2.9 干旱脅迫對赤芍葉片相關(guān)基因表達的影響

植物抗旱性是多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及多基因偶聯(lián)控制的復(fù)雜反應(yīng)，在分子水平上探究抗旱相關(guān)基因表達調(diào)控方式可更加明確赤芍的抗旱機制。本試驗對赤芍進行輕度和重度干旱脅迫處理，分析赤芍干旱應(yīng)答、光合、抗氧化響應(yīng)基因表達水平的變化(圖8)。干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白RpDREB基因表達量升高，重度干旱表達水平明顯高于輕度干旱，第20天時，分別是輕度干旱與對照組的1.93倍和4.69倍；干旱脅迫后，光合相關(guān)基因Psb27和PsaK表達水平上調(diào)，其中重度干旱下光合基因的表達水平顯著上調(diào)；干旱脅迫抑制了抗氧化響應(yīng)基因MDHAR表達，在干旱處理后其表達水平明顯下降，但重度干旱和輕度干旱下基因的表達水平差異不大，而抗氧化基因SOD和GR在重度干旱脅迫后的表達水平明顯上調(diào)后下降，其中SOD較顯著，第16天表達水平達到峰值，分別是輕度干旱與對照組的1.58倍和1.86倍，而后劇烈下降，到第24天時表達水平降到對照組的1.43倍，輕度干旱脅迫下SOD和GR基因表達水平呈穩(wěn)定上升趨勢。

3 討 論

人類活動、全球持續(xù)變暖、土壤干旱與荒漠化加劇了非生物脅迫的發(fā)生率及程度，嚴重影響藥用植物的生長發(fā)育，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成損失。干旱脅迫下植物的形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)、干旱相關(guān)基因的表達等均有不同程度改變。本研究表明，干旱脅迫下赤芍葉片含水量降低，且重度干旱明顯低于輕度干旱和對照組，這與卡德爾[19]報道的馬鈴薯、三葉草、西瓜、玉米研究結(jié)果一致。作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可溶性糖與可溶性蛋白含量受干旱脅迫的影響也較大，赤芍可溶性糖含量持續(xù)增加，加強了赤芍的滲透調(diào)節(jié)作用，可消除或修復(fù)赤芍植株由于環(huán)境干旱引起的應(yīng)激損傷，這與干旱脅迫下馬鈴薯[20]、花棒[21]等植物可溶性糖積累趨勢一致，而赤芍葉片可溶性蛋白呈先增后降的趨勢，可能由于可溶性蛋白多為生物代謝的酶類，干旱脅迫初期，由于赤芍產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)而使體內(nèi)代謝酶的含量增加、酶活提高，致使赤芍葉片可溶性蛋白含量增加，后期由于持續(xù)干旱脅迫，第20天時呈急劇下降趨勢，抑制了赤芍體內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)合成，加之酶快速降解等因素導(dǎo)致赤芍可溶性蛋白含量先增加后顯著降低，細胞內(nèi)滲透物質(zhì)增加是引起滲透勢下降的一個關(guān)鍵因素，體內(nèi)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以維持細胞含水量和膨壓，以保證細胞生長、氣孔開放和光合等生理過程的進行。除可溶性糖與可溶性蛋白外，脯氨酸(Pro)作為赤芍細胞質(zhì)的主要滲透物質(zhì)，干旱脅迫下其含量顯著增加，脯氨酸親水性極強，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及細胞內(nèi)的代謝過程，干旱脅迫下蛋白質(zhì)合成減慢，導(dǎo)致Pro參與蛋白質(zhì)合成量減少，Pro積累直線上升，保持胞質(zhì)內(nèi)溶膠與環(huán)境的滲透平衡，防止細胞失水，增強蛋白質(zhì)的可溶性并減少可溶性蛋白的沉淀，保護這些生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，干旱脅迫產(chǎn)生的氨亦可形成Pro，起到解毒作用；而MDA具有很強的毒性，是膜脂過氧化物作用的主要產(chǎn)物之一，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標志，干旱脅迫下它能與膜上的蛋白質(zhì)氨基酸殘基或核酸反應(yīng)生成shiff堿，增加膜透性。

植物光合參數(shù)會由于干旱脅迫生物量分配的變化而變化，如干旱脅迫初期，赤芍葉片的光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、細胞間隙CO2濃度(Ci)和氣孔導(dǎo)度(Gs)整體變化趨勢一致，而持續(xù)干旱脅迫導(dǎo)致赤芍葉片的光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)均呈下降趨勢，可見赤芍葉片Gs降低，偶聯(lián)Pn和Tr均降低來抵御干旱脅迫，Gs和Tr僅在重度干旱脅迫初期出現(xiàn)急劇下降后緩慢上升的趨勢，可能是前期重度干旱脅迫至16 d導(dǎo)致赤芍葉片氣孔結(jié)構(gòu)嚴重受損，后期干旱脅迫持續(xù)增強也無法做出應(yīng)答反應(yīng)；ABA對植物氣孔運動和基因表達均具調(diào)控作用，干旱脅迫下赤芍ABA含量先增加后降低，這與王得運等[22]研究結(jié)果一致，可能赤芍為響應(yīng)干旱脅迫，ABA含量迅速提高以調(diào)節(jié)氣孔開度緩解干旱脅迫給赤芍帶來的損害，但持續(xù)干旱A(chǔ)BA抵御重度干旱的調(diào)節(jié)機制降低，導(dǎo)致赤芍ABA含量減少；Ci值在重度干旱初期升高不明顯，與對照組、輕度干旱處理差異不顯著，在第12天呈直線上升趨勢，其原因可能是干旱脅迫初期氣孔開度降低但仍可消耗CO2進行光合作用，而持續(xù)脅迫致使氣孔關(guān)閉，光合作用停止，赤芍葉片中CO2含量則劇烈積累增加，這與宋學(xué)貴等[23]研究的竹柳Ci變化趨勢一致；干旱脅迫下赤芍葉片光合作用相關(guān)的基因Psb27和PsaK表達量均顯著上升，表明干旱脅迫損傷了赤芍葉片葉綠體，減弱了光合作用。植株通過提高光合作用相關(guān)基因的表達水平以維持正常生長發(fā)育；此外，光合色素含量亦可直接影響赤芍的光合能力，干旱脅迫下由于活性氧(ROS)代謝失衡，葉綠素分解加速導(dǎo)致葉綠素含量呈線性下降，而赤芍葉片類胡蘿卜素和類黃酮含量增加，可降低干旱脅迫葉綠素的傷害，增加赤芍葉片的抗性；為防止ROS 積累造成的細胞損害，植物進化出保護酶系統(tǒng)(SOD)和AsA-GSH 酶循環(huán)系統(tǒng)(GR)等有效抗氧化防御系統(tǒng)，赤芍通過增加酶活性來清除體內(nèi)積累的ROS。干旱脅迫下，赤芍AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)酶活性和SOD以及GR基因表達水平均呈先升后降趨勢，可能是由于干旱初期SOD正常合成，但持續(xù)干旱脅迫破壞了SOD合成酶的結(jié)構(gòu)，造成SOD基因表達水平降低，這與董守坤等[24]和Wada等[25]研究結(jié)果一致。綜上所述，干旱脅迫對赤芍植株的表型特征、生理特性、光合特性以及相關(guān)基因的表達水平等影響較為顯著，且隨著干旱脅迫程度不同，赤芍植株抗旱響應(yīng)度亦存在較大差異。