白菜型油菜BraSAUR基因家族鑒定及其表達分析

潘巧文，武軍艷，馬學才，王亞林，馬 驪，徐新宇，李 鵬，姚彥林，徐 芳，崔小茹，孫萬倉

(1. 甘肅農業(yè)大學農學院，甘肅省油菜工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070；2. 省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅省農業(yè)技術推廣總站, 甘肅 蘭州 730070)

在自然界中，生長素是人們發(fā)現的第一種植物激素，在調控植物發(fā)育并響應外界環(huán)境刺激時可以通過誘導生長素早期響應基因的快速高表達來促進植物的抗性；生長素早期的應答基因有Aux/IAA(Auxin/indole-aceticacidsproteins，Aux/IAAs)、GH3 (GretchenHagen3)和SAUR(Smallauxin-upRNAs)[1]。SAUR是對生長素反應最快、最強烈、響應程度最大的植物特異性基因家族，它們可以在2～5 min內產生響應[2]。SAUR基因大部分聚集分布在染色體上，一般沒有內含子[3]，大多數在啟動子區(qū)包含一個或多個生長素應答元件，編碼的蛋白質分子量相對較小，生長素誘導后可以快速合成，從而對逆境脅迫做出響應[4]。

作為生長素早期響應基因之一，了解SAUR在植物發(fā)育中的作用具有重要意義。目前在擬南芥中檢測到了72個SAUR基因，水稻[5]中有58個，葡萄[6]中有64個，白菜中有143個[7]。相關研究表明，白菜SAUR基因家族之間的分化擴增是導致大量基因重復的因素之一，而且已證實白菜SAUR基因間的表達模式存在較大差異，即這些基因的功能可能已經發(fā)生分化[8]。SAUR的轉錄本主要存在于干細胞和根、莖中，可能作為信號分子以某種未知的方式在維持生長素水平、調節(jié)生長素運輸和細胞擴張方面發(fā)揮重要作用，這使得探索SAUR整個基因家族的功能具有重要意義[9]。

油菜是甘肅省第一大油料作物，種植面積18萬hm2左右，由于生態(tài)環(huán)境多樣、地域差異大，因此甘肅省冬、春油菜均有種植，其中冬油菜種植面積近11萬hm2[10]。白菜型冬油菜是甘肅省冬油菜產區(qū)的主要栽培類型，在越冬前，隨著溫度的降低，其葉片逐漸干枯，返青后在生長點(頂端分生組織)重新長出新葉完成其生殖生長[11]。植物生長素主要是在頂端分生組織中合成，之后被運輸到植物體的各個部分[12]，在此過程中，SAUR基因作為植物早期生長素響應基因家族，在生長素誘導的酸性生長中起著核心作用[13]。因此，本研究鑒定了白菜型油菜的SAUR基因信息，通過轉錄組測序初步分析了其在白菜型冬油菜生長點的表達特性，篩選差異表達基因，比較不同脅迫處理下差異表達基因在白菜型冬油菜品種中的相對表達量，探究生長素早期應答基因調控白菜型冬油菜生長點發(fā)育的機理，旨在為后期研究白菜型油菜SAUR的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以甘肅農業(yè)大學提供的強抗寒性白菜型冬油菜品種隴油7號(L7)和弱抗寒性冬油菜品種隴Lenox(X)為試驗材料。

1.2 試驗設計

1.2.1 基因家族鑒定、理化性質及進化分析 參照李婉雪等[14]的方法得到鑒定基因的相關信息。用Expasy Protparam 軟件預測SAUR家族成員的所有氨基酸序列、分子量、等電點及疏水性等。通過在線軟件Plant-mPLoc對SAUR進行亞細胞定位預測。用MEGA 7.0繪制基因家族進化樹。

1.2.2 基因結構和氨基酸保守序列分析 參照武軍艷等[11]方法分析SAUR家族的保守基序，尋找motif的數量為10、寬度在15～41個氨基酸之間。用基因結構顯示服務器GSDS進行繪制。

1.2.3 基因家族成員在染色體上的定位 用MapChatr軟件繪制基因位置與染色體位置。

1.2.4 基因家族啟動子區(qū)順式作用元件分析 提取白菜型油菜中鑒定到的SAUR基因編碼區(qū)上游1.5 kb的序列，參照李珊等[15]的方法分析順式作用元件，用GSDS繪圖。

1.2.5 基因家族同源關聯(lián)分析 參照馬倩等[16]的方法進行共線分析。

1.2.6 白菜型冬油菜SAUR基因家族表達模式分析 挑選L7和X的干凈、飽滿種子，蒸餾水清洗除雜后，置于覆蓋兩層水浸濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，室溫下待其露白后選取健壯幼苗移栽至花盆中，在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(24℃，光照12 h，黑暗12 h)，每個品種10盆，每盆4株幼苗，當幼苗生長至3～5葉期時進行脅迫處理。

(1)取長勢均勻一致的3盆，轉移至4℃低溫培養(yǎng)箱(光照12 h，黑暗12 h)，分別于0(CK)、3 、24 h取相同部位的生長點，每個處理3次生物學重復，用蒸餾水清洗、濾紙干燥，立即液氮冷凍后送至上海歐易生物有限公司進行轉錄組分析。

(2)低溫脅迫：每個品種各取長勢均勻一致的3盆，轉移至4℃低溫培養(yǎng)箱(光照12 h，黑暗12 h)，分別于0(CK)、1、24 h取樣。PEG模擬干旱脅迫：各品種挑選長勢一致的3盆，從根部灌入250 ml 20% PEG營養(yǎng)液，分別于0(CK)、1、24 h取樣。低溫與干旱脅迫取樣組織均為油菜葉片和生長點，每個處理3次生物學重復，用蒸餾水清洗、濾紙干燥，立即液氮冷凍，在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)RNA提取：按照Steady Pure植物RNA提取試劑盒(AG21019 )說明書方法提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據TaKaRa-cDNA第一鏈合成試劑盒(RR036A)進行反轉錄得到cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨蟽煞N試劑盒均購自天根生物科技有限公司。

(4)熒光定量引物設計：從鑒定獲得的白菜型油菜SAUR基因家族的序列文件中提取CDS序列，通過Primer 5.0軟件設計熒光定量特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)，參考基因為已報道的穩(wěn)定表達的內參基因Actin。

表1 熒光定量引物序列

1.3 數據處理

用Excel和SPSS軟件分析。

2 結果與分析

2.1 BraSAUR基因家族的鑒定和蛋白質理化性質分析

從白菜型油菜基因組中鑒定出142個SAUR基因，分別命名為BraSAUR001～BraSAUR142。理化信息分析結果表明，該家族基因編碼的蛋白質分子量從6750.8 Da到23271.3 Da，蛋白質等電點從4.58 (Bra002330)到11.40(Bra029452)，其中111個蛋白質偏堿性，30個偏酸性，1個(Bra012231)為中性，可見，BraSAUR基因編碼的蛋白質大多數偏堿性，接近酸性蛋白質的4倍。脂肪族指數在61.26～100.38之間，表明脂肪鏈在蛋白質中所占比重高，均為脂溶性蛋白。疏水性預測得出大多數蛋白親水性好，親水蛋白是疏水蛋白的6倍。不穩(wěn)定指數的預估結果表明，有33個蛋白在體外是穩(wěn)定的，其他蛋白不穩(wěn)定指數均大于40。亞細胞定位預測表明，87個家族成員位于細胞核內，48個位于細胞質內，7個位于葉綠體內。

2.2 BraSAUR基因結構及系統(tǒng)進化樹分析

142個BraSAUR基因大多數的cDNA長度在500 bp以內。131個不含有內含子，只有一個長度500 bp以內的外顯子，90%的長度相近，比較保守；11個基因有內含子。BraSAUR基因分為4個亞家族 (Group1～ Group 4)：Group1(36個)、Group2(14個)、Group3(7個)、Group4(85個)(圖1，見7頁)。各個亞家族基因的分化從剛開始的均勻對稱分支，再到之后的偏向不均等分支分化。這種偏向可能與該物種在進化過程中經歷的自然選擇有關。

圖1 BraSAUR基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of members of BraSAUR gene family

2.3 BraSAUR基因家族的定位

BraSAUR基因分布在10條染色體上，見圖2。3號染色體上分布的基因最多，有26個，1號染色體上12個，2號染色體上22個，4號染色體上7個，5號染色體上8個，6號染色體上9個，7號染色體上11個，8號染色體上13個，9號染色體上14個，10號染色體上17個。

圖2 1～10號染色體上BraSAUR基因的定位(a) 及各染色體上的基因數量(b)Fig.2 Location of BraSAUR gene on chromosomes 1～10(a) and Quantity of genes on each chromosome(b)

2.4 BraSAUR蛋白保守氨基酸序列分析

BraSAUR含有的氨基酸保守基序數量和種類不同(圖3)，共有10個motif序列。蛋白的保守氨基酸基序從5’-3’方向出現的前后順序是motif 6、motif 4、motif 1、motif 3、motif 7、motif 5 、motif 2、motif 10、motif 8和motif 9。家族蛋白中一半以上都含有motif 2，但motif10只在6個蛋白中出現。各個亞家族成員結構相似，蛋白的保守結構域也相似。

圖3 BraSAUR家族基因編碼蛋白保守motif序列Fig.3 Conserved motif structure of proteins encoded by BraSAUR family genes

2.5 BraSAUR家族基因的啟動子分析

預測啟動子區(qū)域的順式作用元件，得到許多響應環(huán)境信號、激素響應因子和轉錄調控位點在內的順式元件。每個成員包含多個順式作用元件，共同調控著基因的表達，在不同的外界信號刺激下發(fā)揮不同的作用。由圖4中看出不同亞家族中含有作用元件的種類相同，數量上有所差別。大多數BraSAUR基因含有調控轉錄的重要功能位點。

2.6 BraSAUR基因家族成員同源復制分析

除了A1和A8染色體沒有發(fā)現共線基因(圖5)，其余8條染色體上的26個基因發(fā)生了17組共線關系，A3染色體上5個基因發(fā)生了7條共線關聯(lián)；相鄰近染色體(A2、A5)和遠端染色體(A9、A10)都存在串聯(lián)重復，A3(Bra023055)與A5(Bra005223、Bra005293)和A9(Bra006984)都有基因串聯(lián)復制關系。A6(Bra024482)與A7(Bra039909)和A9(Bra037243)存在兩兩復制。串聯(lián)復制基因占基因家族的20%，表明部分BraSAUR可能是基因關聯(lián)復制產生，復制事件是基因家族擴張的重要方式之一。

BraSAUR基因與同科植物擬南芥同源基因有80個，在擬南芥5條染色體上都存在共線性關系(圖6，見10頁)。其中擬南芥4號染色體上的基因與所有BraSAURs都有共線關聯(lián)，共線的基因數目最多。

圖6 BraSAUR基因與擬南芥AtSAUR基因同源共線分析Fig.6 Analysis of homology and collinearity among BraSAUR and AtSAUR

2.7 BraSAURs表達模式分析

2.7.1BraSAURs基因的轉錄分析 為了研究BraSAURs基因在白菜型冬油菜中的低溫響應，分析了它們在不同抗寒性品種生長點的轉錄表達情況。結果表明，84個BraSAURs基因在兩個品種中均不表達(圖7)。在強抗寒性品種L7中，Bra017676和Bra033581在低溫處理3 h時上調表達明顯，在處理24 h時Bra034651、Bra006577和Bra020128等表達上調；Bra025981、Bra016493等則隨著低溫處理時間的延長下調表達。在弱抗寒性品種X中，低溫處理3 h時Bra026044和Bra000497表達上調，Bra027984下調表達，處理24 h時Bra017680、Bra006430、Bra011563、Bra002131和Bra008209等下調表達(圖7)。挑選了14個差異表達顯著的基因，其中上調表達基因6個(Bra09452、Bra000497、Bra010501、Bra020128、Bra006577、Bra034651)，下調表達基因8個(Bra011563、Bra008209、Bra002131、Bra015831、Bra00643、Bra025981、Bra017680、Bra033581)做qRT-PCR驗證。

2.7.2BraSAURs基因在低溫脅迫下的表達 白菜型冬油菜在其整個生產過程中經常面臨冷害和凍害的威脅。因此用抗寒性不同的油菜品種L7和X，通過4℃脅迫，取其葉片及生長點組織，分析選取的14個BraSAURs基因的相對表達量。

(1)在葉片中的表達。在強抗寒性品種L7中，1 h有5個基因表達上調，至24 h有13個基因表達上調，且上調倍數較大(圖8)。在弱抗寒性品種X中，1 h時11個基因表達上調，到24 h時12個基因表達量均低于對照。可見在X中1 h表達量高的基因數目多于24 h，而在L7中卻相反。在兩個品種中，與對照相比Bra029452表達量差異最明顯，在24 h時，L7中的表達量是X的24倍。

(2)在生長點中的表達。生長點是冬油菜越冬的重要部位。低溫脅迫后，在L7中各基因1 h的表達量均低于24 h，而在X中，有10個基因1 h的表達量均高于24 h(圖9)；可見在弱抗寒性品種中基因表達對低溫的反應更迅速。其中Bra029452、Bra011563、Bra010501和Bra033581在L7中24 h的表達量顯著上調(P<0.05)。低溫脅迫后Bra010501在兩個品種中都高表達；在L7中是遞增，到24 h時是對照的4倍，在X中是先增加后降低。

圖9 低溫脅迫下 BraSAURs基因在生長點中的相對表達量Fig.9 Relative expression of BraSAURs gene in grow core(gc) under low temperature stress

2.7.3BraSAURs基因在PEG模擬干旱脅迫下的表達

(1)在葉片中的表達。隨著脅迫時間的延長，Bra002131、Bra010501、Bra015831和Bra006577在兩個品種中的表達趨勢相似(圖10)；Bra029452在L7中表達量逐漸增加，且與CK比較，1 h和24 h均差異顯著(P<0.05)，但在X中則是逐漸降低。Bra020128則剛好相反，在L7中表達量逐漸降低，但在X中則是逐漸升高。

圖10 PEG干旱脅迫下BraSAURs基因在葉片中的相對表達量Fig.10 Relative expression of BraSAURs gene in leaves under PEG drought stress

(2)在生長點中的表達。隨著干旱脅迫時間的延長，有11個基因在兩個品種中表達趨勢相似(圖11)。Bra029452在L7中表達量先升高然后降低，與CK比較，1 h和24 h均差異顯著(P<0.05)，但在X中則是先降低后升高。Bra000497在L7中表達量逐漸降低，在X中則是逐漸升高。

圖11 PEG干旱脅迫下BraSAURs基因在生長點中的相對表達量Fig.11 Relative expression of BraSAURs gene in grow core(gc) under PEG drought stress

3 討 論

隨著全基因組測序的完成，擬南芥、水稻、馬鈴薯、玉米、桑樹、葡萄及西瓜[13，17-21]中的SAUR基因家族均已鑒定。本研究從白菜型油菜全基因組中鑒定出142個SAUR基因，與其他已報道的物種相比，白菜型冬油菜中的SAUR基因數目偏多，說明白菜型冬油菜的SAUR基因在進化過程中經歷了大量的基因擴張。白菜型冬油菜SAUR基因中20%的SAUR基因存在著串聯(lián)重復與片段重復，這可能是因為白菜型油菜在幾百萬年以前發(fā)生了加倍事件，這種基因組加倍導致了SAUR基因家族的擴張分化[22]。

擬南芥中只有1個基因含有內含子[4]，水稻中所有SAUR基因都不含內含子[9]。玉米[18]中3個基因、番茄[19]中3個基因、馬鈴薯[13]中9個基因、黃瓜[13]中6個基因含有內含子。白菜型冬油菜的SAUR基因也存在這種現象，有11個基因存在內含子，占總家族數量的7.74%，無內含子的基因占92.26%；一般情況下無內含子的基因可變剪切的發(fā)生率往往很低[22]，因此SAUR家族基因的功能可能會相對保守一些。本研究中大多數基因至少存在一種激素響應元件，如赤霉素響應元件，說明該基因參與植物赤霉素調控的生理活動[23]。BraSAUR家族包含特異的80～120個氨基酸組成的保守結構域，該結構域包含生長素超家族基因的重要組成成員，這種現象在馬鈴薯[13]、擬南芥[24]、水稻[9]與玉米[25]中也有報道。

本研究中低溫脅迫后兩個品種的不同組織有不同的響應，強抗寒性品種L7的葉片及生長點組織對低溫均響應較慢，到脅迫24 h時基因表達呈現出顯著變化；而弱抗寒性品種X的葉片和生長點組織對低溫的響應均比較靈敏，1 h時基因表達即發(fā)生顯著變化，快速對脅迫做出響應，這與Zeng等[26]的研究結果相似。此外，在兩個品種中均表現為脅迫后生長點組織中顯著表達的基因數目多于葉片，這與趙玉紅等[27]的研究結果有類似之處。這種現象可能與白菜型冬油菜的表型有關，強抗寒性品種L7下胚軸短，生長點凹陷、低于地表，葉片匍匐生長，而弱抗寒性品種X下胚軸長、生長點高于地表，葉片直立、半直立生長[28]。本研究發(fā)現低溫脅迫后誘導表達的BraSAUR基因比干旱脅迫的多，且表達量高，說明在白菜型冬油菜中SAUR基因可能在應對低溫脅迫中起主要作用。本研究中分別在低溫脅迫和干旱脅迫條件下，發(fā)現Bra029452基因表達在強抗寒性油菜品種L7的葉片及生長點中均逐漸升高(除在干旱脅迫條件下L7生長點中呈現先升高后降低的趨勢外)，可推斷該基因同時參與白菜型冬油菜耐受低溫、干旱的調控過程。因此，這個基因如何響應白菜型油菜的逆境脅迫可作為下一步的研究工作。

4 結 論

白菜型油菜有142個SAUR家族成員，在10條染色體上都有分布，呈現簇狀分布，其中3號染色體上數量最多；其基因長度較短，只有11個基因有內含子。低溫脅迫后，BraSAUR基因在X中1 h表達量高的基因數目多于24 h，而在L7中卻相反，可見在弱抗寒性品種中其對低溫的反應更迅速。干旱脅迫后，Bra029452在兩個品種的葉片及生長點中均存在差異，在L7的葉片中表達量逐漸增加，但在X中則是逐漸降低；而在L7的生長點中表達量先升高然后降低，在X中則是先降低后升高。低溫脅迫后誘導表達的BraSAUR基因比干旱脅迫的多，且表達量高。