阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用對小鼠腦缺血恢復(fù)期RAGE及sRAGE表達(dá)的影響

溫少紅，劉向榮，趙順英，董雯，陳青芳，陳文濤，李子孝，2，王春娟，2

卒中是我國居民的第三位死亡原因，其中缺血性卒中占80%，是獲得性長期殘疾的第一大原因[1]。研究證實(shí)阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合治療21 d可降低輕型缺血性卒中或TIA患者的卒中復(fù)發(fā)率和致殘率[2-3]。但目前缺少阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合治療有效性的機(jī)制研究。

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是免疫球蛋白超家族成員之一，廣泛存在于神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中[4-5]，可以作為細(xì)胞壞死性死亡的傳感器，促進(jìn)炎癥發(fā)生并加劇缺血性腦損傷[6-7]；另一方面，可溶性RAGE（soluble RAGE，sRAGE）作為誘餌受體，可以與細(xì)胞表面的RAGE競爭配體，從而阻斷RAGE介導(dǎo)的炎癥相關(guān)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。腦缺血引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)會導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷和細(xì)胞死亡，同時(shí)也在組織重塑和修復(fù)中發(fā)揮重要作用[9]。因此，推測RAGE和sRAGE在缺血性卒中的病理生理機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。本研究旨在探索阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用對小鼠大腦中動脈遠(yuǎn)端缺血再灌注模型恢復(fù)期RAGE及sRAGE表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取8～10周C57BL/6雄性小鼠60只，購于北京華阜康生物科技控股有限公司。本實(shí)驗(yàn)遵照北京市神經(jīng)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會要求進(jìn)行（動物倫理批號：202002003），實(shí)驗(yàn)小鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，相對濕度50%～60%，12 h循環(huán)照明。

1.2 模型制作 小鼠稱體重后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、溶劑組、阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合組（雙抗組），每組各20只。小鼠大腦中動脈遠(yuǎn)端缺血再灌注模型（distal middle cerebral artery occlusion-reperfusion，dMCAO-R）制作方法如下：異氟醚麻醉小鼠，在小鼠右眼和右耳之間進(jìn)行皮膚切口，在顱骨上鉆孔，使用30G鈍頭針壓迫暴露的大腦中動脈遠(yuǎn)端；血管閉塞60 min后取針實(shí)現(xiàn)腦血流部分再灌注[10]。假手術(shù)組在顱骨上鉆孔后只分離血管，不壓迫大腦中動脈遠(yuǎn)端。術(shù)中通過激光多普勒血流儀（瑞沃德，中國）監(jiān)測腦血流判斷模型是否成功，體溫維持儀維持小鼠術(shù)中肛溫37±0.5 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)用藥的溶液配制與給藥 本研究所用阿司匹林為拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)的阿司匹林腸溶片（每片100 mg，批號BJ49807）；氯吡格雷為賽諾菲（杭州）制藥有限公司生產(chǎn)的硫酸氫氯吡格雷片（每片75 mg，批號9A866）。阿司匹林和氯吡格雷混合液配制方法：①取阿司匹林腸溶片用研缽磨碎，將藥粉轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入8.333 mL飲用水，吹打均勻并標(biāo)記；②取硫酸氫氯吡格雷片用研缽磨碎，將藥粉轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，加入6.250 mL飲用水，吹打均勻并標(biāo)記；③分別取6.250 mL阿司匹林混合液、6.250 mL氯吡格雷混合液、12.500 mL飲用水混合，此混懸液中阿司匹林和氯吡格雷的濃度均為3 mg/mL。模型前小鼠體質(zhì)量為25 g，阿司匹林和氯吡格雷給藥劑量均為12 mg/kg，因此每只小鼠每次需混懸液體積100 μL。雙抗組再灌注后即刻灌胃給予阿司匹林和氯吡格雷混懸液100 μL，后每日同劑量灌胃1次，連續(xù)21 d；溶劑組給予同等體積飲用水灌胃，持續(xù)21 d；假手術(shù)組不給藥。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1.4 神經(jīng)功能評價(jià) 腦缺血后1、3、5、7、9、11、14、21 d分別進(jìn)行改良加西亞神經(jīng)功能評分，該評分包括本體感覺、胡須碰觸、肢體對稱性、側(cè)轉(zhuǎn)向和前肢行走5項(xiàng)，每項(xiàng)滿分3分，總分15分[11]。1.5 取材 21 d神經(jīng)功能評價(jià)結(jié)束后，進(jìn)行小鼠眼球內(nèi)眥采血和腦組織取材。

眼球內(nèi)眥采血：麻醉小鼠后，用左手手指壓迫小鼠頸部兩側(cè)，使眼球充分外突，右手持毛細(xì)采血管沿內(nèi)眥插入內(nèi)眼角，輕輕向眼底方向刺入，收集血液。3000 rpm離心10 min留取血清置于-80℃冰箱備用，后續(xù)用于酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中sRAGE表達(dá)水平（每組6只）。

腦組織：①麻醉小鼠后，使用手術(shù)器械依次剪開頭皮、顱骨，取出小鼠大腦，分離缺血側(cè)皮層組織置于-150 ℃冰箱備用。部分用于免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測RAGE相對表達(dá)水平（每組5只）；部分用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測炎癥因子及RAGE的mRNA表達(dá)水平（每組5只）。②麻醉小鼠后，依次采用磷酸鹽緩沖液、固定液對小鼠進(jìn)行心臟灌流，灌流結(jié)束后取大腦依次浸泡于固定液、30%蔗糖溶液中，后續(xù)進(jìn)行冰凍切片及免疫熒光染色（每組4只）。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 取血清樣本，采用小鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物特異性受體ELISA試劑盒（CSB-EL001441MO，武漢華美生物）檢測血清sRAGE表達(dá)水平。具體方法如下：向酶標(biāo)板中依次加入樣本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗RAGE抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，洗滌后用底物顯色。底物在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀（TECAN，瑞士）在450 nm波長下測定吸光度（optical density，OD），計(jì)算樣本中sRAGE濃度。

1.7 免疫印跡試驗(yàn) 取小鼠缺血側(cè)皮層組織樣本，研磨后12 000 rpm離心20 min，取上清液經(jīng)BCA蛋白檢測試劑盒（Pierce，美國）定量后依次進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜、膜的封閉、一抗（Proteintech，美國，稀釋比例1∶800）孵育、二抗（抗鼠IgG，CST，美國，稀釋比例1∶2500）孵育、發(fā)光液顯影，通過G：BOX化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Syngene，英國）檢測蛋白條帶，使用Image J軟件分析圖像并計(jì)算RAGE的相對表達(dá)量。內(nèi)參抗體為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（景杰生物，中國，稀釋比例1∶1000）。

1.8 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 應(yīng)用RNA提取試劑盒（Qiagen，德國）提取小鼠缺血側(cè)皮層組織RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。應(yīng)用2-ΔΔCt計(jì)算溶劑組、雙抗組與假手術(shù)組之間擴(kuò)增指標(biāo)的相對表達(dá)量。擴(kuò)增指標(biāo)包括CD16、CD32、CD11b、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric-oxide synthase，iNOS）、CD206、精氨酸酶1（arginase1，Arg1）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、幾丁質(zhì)酶樣蛋白（chitinase-like 3，Chil3/Ym1/2）、RAGE。引物購自英維捷基（上海）貿(mào)易有限公司，其序列見表1[12]，其中RAGE引物序列采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)。

表1 引物序列

1.9 免疫組織熒光染色 取小鼠腦組織樣本進(jìn)行冰凍切片。切片依次進(jìn)行破膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）封片。其中一抗RAGE（Proteintech，美國，稀釋比例1∶200）分別與神經(jīng)元特異核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）（Merck，美國，稀釋比例1∶500）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（CST，美國，稀釋比例1∶500）免疫熒光共染，標(biāo)記神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。使用激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）觀察RAGE與梗死周邊區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共定位情況并拍照，使用Image J軟件對RAGE+NeuN+細(xì)胞計(jì)數(shù)。1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以表示；多時(shí)間點(diǎn)多組比較采用雙因素方差分析，在整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下進(jìn)行Bonferroni法兩兩比較；單時(shí)間點(diǎn)多組比較采用單因素方差分析，在整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分結(jié)果 缺血再灌注后1、3、5、7、9、11、14、21 d評價(jià)小鼠改良加西亞評分，結(jié)果顯示3組間本體感覺、胡須碰觸和總分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較顯示，溶劑組各時(shí)間點(diǎn)各分項(xiàng)評分及總評分均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雙抗組各時(shí)間點(diǎn)各分項(xiàng)評分及總評分均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雙抗組3 d時(shí)胡須碰觸評分（P=0.0067）、3 d時(shí)總評分（P=0.0140）、9 d時(shí)總評分（P=0.0406）高于溶劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 缺血再灌注后小鼠不同時(shí)間改良加西亞評分結(jié)果[單位：分]

2.2 血清sRAGE及缺血側(cè)皮層RAGE表達(dá)水平缺血再灌注21 d時(shí)，3組間血清sRAGE水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較顯示，雙抗組血清sRAGE水平高于溶劑組（P=0.0120）；3組間缺血側(cè)皮層RAGE相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3，圖2）。

圖2 缺血再灌注21 d小鼠血清sRAGE濃度及缺血側(cè)皮層RAGE相對表達(dá)量

表3 缺血再灌注21 d小鼠血清sRAGE濃度及缺血側(cè)皮層RAGE相對表達(dá)量

2.3 缺血側(cè)皮層炎癥因子及RAGE的mRNA相對表達(dá)情況 缺血再灌注21 d，3組間除Arg1外，缺血側(cè)皮層其他炎癥因子和RAGE的mRNA相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。兩兩比較顯示，與假手術(shù)組相比，溶劑組各炎癥因子和RAGE的mRNA水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與假手術(shù)組相比，雙抗組除CD32、iNOS外，其他其他炎癥因子和RAGE的mRNA水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與溶劑組相比，雙抗組iNOS（P=0.0164）、RAGE（P=0.0071）的mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

表4 缺血再灌注21 d小鼠缺血側(cè)皮層炎癥因子及RAGE的mRNA相對表達(dá)量

2.4 缺血小鼠腦梗死周邊區(qū)RAGE和神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共定位情況 缺血再灌注21 d，采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)RAGE+/NeuN+細(xì)胞在單位面積（1 mm2）的數(shù)量，假手術(shù)組為421.391±122.56個(gè)，溶劑組為814.437±165.758個(gè)，雙抗組為328.798±35.183個(gè)，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.24，P=0.0007）；兩兩比較顯示，假手術(shù)組、雙抗組與溶劑組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0088、0.0012）（圖3）。

3 討論

目前，阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合治療已廣泛應(yīng)用于臨床預(yù)防輕型缺血性卒中和TIA的復(fù)發(fā)，因其可以改善卒中患者發(fā)病90 d的功能預(yù)后，降低卒中復(fù)發(fā)的整體致殘率[3-4]。根據(jù)臨床研究結(jié)果以及本課題組前期的基礎(chǔ)研究，阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合治療的最佳臨床獲益時(shí)間為卒中發(fā)生后的前3周內(nèi)[2，10，13]，因此本研究選擇小鼠腦缺血再灌注后21 d作為各項(xiàng)指標(biāo)的考察時(shí)間，旨在探索阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合治療可能的保護(hù)機(jī)制。本研究神經(jīng)功能評價(jià)的結(jié)果顯示，阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合給藥可以在一定程度上提高腦缺血再灌注小鼠改良加西亞評分（3 d時(shí)胡須碰觸評分、3 d時(shí)總分、9 d時(shí)總分），提示其可以促進(jìn)腦缺血再灌注小鼠短期神經(jīng)功能的恢復(fù)。

RAGE是一種涉及多種慢性炎癥狀態(tài)的多配體模式識別受體，可以結(jié)合并介導(dǎo)一系列與損傷相關(guān)分子模式分子的細(xì)胞反應(yīng)。細(xì)胞和動物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，阻斷RAGE信號可以減輕炎癥反應(yīng)，減少糖尿病血管并發(fā)癥、心血管疾病以及腫瘤的進(jìn)展[14]。本研究中，缺血再灌注21 d時(shí)，雙抗組小鼠血清sRAGE水平較溶劑組升高（P=0.0120），缺血側(cè)皮層中RAGE的mRNA相對表達(dá)量較溶劑組降低（P=0.0071），提示阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合治療除了抗血小板外，還可能通過上調(diào)sRAGE的表達(dá)水平，減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)。

本研究還考察了小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的相對表達(dá)量，其中雙抗組和溶劑組的CD16、CD32、CD11b、CD206、Arg1、TGF-β、Ym1/2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究提示缺血性卒中后梗死周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生動態(tài)極化[12]：M2型小膠質(zhì)細(xì)胞（抗炎表型）表達(dá)在7 d內(nèi)短暫性升高而后逐漸下降，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞（促炎表型）表達(dá)在3 d時(shí)開始逐漸升高直至14 d出現(xiàn)下降。推測在本研究選取的考察時(shí)間，即卒中后21 d，小膠質(zhì)細(xì)胞不同表型的表達(dá)已處于動態(tài)平衡，因此未能觀測到相關(guān)炎癥因子的變化。值得關(guān)注的是，雙抗組小鼠缺血側(cè)皮層中促炎因子iNOS的表達(dá)水平較溶劑組顯著下降（P=0.0164）。缺血誘導(dǎo)的iNOS+炎癥細(xì)胞除了直接釋放NO外，還通過產(chǎn)生各種炎癥因子觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[15]。推測iNOS與RAGE在缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生了協(xié)同作用，另一方面iNOS表達(dá)水平下調(diào)也可能與sRAGE表達(dá)上調(diào)相關(guān)。sRAGE可在心血管疾病中抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，被認(rèn)為是心血管事件發(fā)生和復(fù)發(fā)的重要標(biāo)志物[16]。已有報(bào)道提示sRAGE在急性缺血性卒中患者功能預(yù)后中具有保護(hù)性作用，發(fā)病48 h時(shí)其血漿表達(dá)水平是急性缺血性卒中患者預(yù)后顯著的預(yù)測指標(biāo)[17]。

本研究在動物模型中對腦缺血后RAGE、sRAGE及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平的變化進(jìn)行了分析，但測定的時(shí)間點(diǎn)為恢復(fù)期（21 d），不能明確上述指標(biāo)在腦缺血急性期內(nèi)的變化趨勢，并與小鼠缺血急性期內(nèi)的神經(jīng)功能變化相對應(yīng)。后續(xù)研究將進(jìn)一步深入探索腦缺血后上述炎癥指標(biāo)的變化曲線及其可能的互相影響的機(jī)制。

【點(diǎn)睛】阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用可在小鼠腦缺血恢復(fù)期調(diào)控RAGE表達(dá)，減輕炎癥，發(fā)揮腦保護(hù)作用。