駱益華 吳麗娜 吳 俊 趙 明 邵飛琴 張偉群
1.杭州市臨安區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,浙江杭州 311300;2.杭州市臨安區(qū)疾病預(yù)防控制中心,浙江杭州 311300
艱難梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)(cell cytotoxicity assay,CCTA)、厭氧培養(yǎng)法、免疫學(xué)毒素檢測(cè)包括酶聯(lián)免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)方法等,但是各種方法均存在一定的缺點(diǎn)和局限性。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是一種核酸擴(kuò)增方法,該方法使用4 對(duì)引物檢測(cè)位于tcdA5 端的6個(gè)不同保守區(qū)域,在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增,具有快速、費(fèi)用低、敏感度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。
本研究旨在研究利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)結(jié)合核酸試紙條技術(shù)建立一種艱難梭菌快速檢測(cè)的方法。
采集2016 年1 月至2017 年12 月杭州市臨安區(qū)第一人民醫(yī)院臨床感染性腹瀉患者的糞便標(biāo)本201份,所有糞便標(biāo)本均于-80℃冷凍保存。沙門菌、副溶血性弧菌、志賀菌、致病性大腸埃希菌、創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌共7 個(gè)菌株,均為標(biāo)準(zhǔn)菌株。
臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);CFX-96 Touch 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀;生物安全柜(NU-543-600S);超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo NDONE-W);高熱滅菌器(日本松下公司);恒溫培養(yǎng)箱(日本松下公司);冰箱(日本三洋公司)。LAMP脫氧核糖酸擴(kuò)增試劑盒(日本榮研株式會(huì)社);熒光目視檢測(cè)試劑盒(日本榮研株式會(huì)社);DNA Kit 提取試劑盒;溶菌酶。
1.3.1 艱難梭菌的培養(yǎng) 取200mg 糞便樣本裝入1.5ml 的EP 管中,加入800μl 無水乙醇,漩渦震蕩至糞便均勻分散,室溫靜置1h,8000 轉(zhuǎn)/min 離心2min,棄上清,用500μl 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)混勻后全量倒入烘烤后的艱難梭菌分離平板上(平板需提前在烘箱內(nèi)烘烤40~50min),涂布直至液體收干,放入?yún)捬鹾兄?7℃培養(yǎng)48h,挑取單菌落接種至血平板上,37℃再培養(yǎng)48h,保存菌株。
1.3.2 艱難梭菌DNA 的提取 取1.5ml 的EP 管,裝入200μl PBS 溶液,用接種環(huán)接入足量菌,加入100μl 20mg/ml 的溶菌酶,漩渦振蕩后放入55℃水浴鍋孵育1h,取出EP 管,快速離心使管壁上液體回落,加入20μl 蛋白酶K,200μl 緩沖AL,混勻后56℃水浴10min,離心,加入200μl 無水乙醇,混勻15s,離心,將所有液體小心加入吸附柱,8000 轉(zhuǎn)/min 離心1min,棄下管,換新的收集管,加入Buffer AW1 500μl,8000 轉(zhuǎn)/min 離心1min,換新的收集管,加入Buffer AW2 500μl,14000 轉(zhuǎn)/min 離心3min,換新的收集管,14000 轉(zhuǎn)/min 離心1min。將吸附柱換到干凈的EP 管中加入200μl 緩沖AE,室溫靜置1min,8000 轉(zhuǎn)/min 離心1min 即得DNA 提取液(DNA 濃度用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量并記錄),-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取已知的艱難梭菌基因tcdA 基因序列,選擇區(qū)域分別設(shè)計(jì)LAMP 反應(yīng)所需的4~6 條引物,引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。
1.3.4 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系及引物篩選 應(yīng)用LAMP 通用試劑盒檢測(cè)艱難梭菌,通過比較各組引物的反應(yīng)結(jié)果優(yōu)劣,篩選出較好的引物組合。LAMP擴(kuò)增法的反應(yīng)體系為25μl:2×反應(yīng)緩沖液(Tris-HCl(pH=8.8)40mmol/L,KCl 20mmol/L,MgSO16mmol/L,(NH)SO20mmol/L,Tween20 0.2%,Betaine 1.6mol/L,dNTPS 2.8mmol/L)12.5μl,Bst DNA 聚合酶 1.0μl,F(xiàn)3(10μmol/L)0.25μl,B3(10μmol/L)0.25μl,F(xiàn)IP(10μmol/L)2.25mol/L,BIP(10μmol/L)2.25μl,F(xiàn)IP-Bio(10μmol/L)1.75μl,LF-Fit(10μmol/L)1μl,Sterilized ddHO 0.75μl。另再加鈣黃綠素指示劑1μl。將反應(yīng)體系混勻后,在CFX-98 熒光定量PCR 儀上63℃等溫?cái)U(kuò)增60min。根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線及顏色變化判斷最終結(jié)果,出現(xiàn)熒光綠判定為陽性,橙色為陰性。再采用試紙條裝置進(jìn)行檢測(cè),觀察結(jié)果。
1.3.5 LAMP 反應(yīng)條件優(yōu)化 反應(yīng)體系根據(jù)反應(yīng)溫度的不同進(jìn)行優(yōu)化,每組反應(yīng)進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)。反應(yīng)溫度分別設(shè)為60、61、62、63、64、65℃。
1.3.6 LAMP 檢測(cè)敏感度試驗(yàn) 將提取的艱難梭菌DNA 模板用Sterilized ddHO 進(jìn)行10 倍梯度稀釋,7個(gè)梯度分別為8ng/μl、0.8ng/μl、0.08ng/μl、8pg/μl、0.8pg/μl、0.08pg/μl、8fg/μl,進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增60min,用鈣黃綠素目視及核酸試紙條檢測(cè),確定艱難梭菌LAMP 法的檢出限。
1.3.7 LAMP 檢測(cè)特異性試驗(yàn) 對(duì)7 種腹瀉干擾菌(沙門菌、副溶血性弧菌、志賀菌、致病性大腸桿菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌)進(jìn)行培養(yǎng),挑取單菌落分別提取DNA,然后進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增60min,用鈣黃綠素目視和核酸試紙條檢測(cè),檢測(cè)艱難梭菌LAMP 的特異性。
按照不同引物配方及引物濃度進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增。引物配方4 呈現(xiàn)熒光綠,核酸試紙條也呈陽性,因此艱難梭菌tcdA 最佳引物配方為配方4,見表1。
表1 擴(kuò)增tcdA 基因的LAMP 最佳引物序列配方
按照不同反應(yīng)溫度進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示,不同的溫度對(duì)艱難梭菌LAMP 擴(kuò)增的影響較大,擴(kuò)增結(jié)果差異明顯,陽性的顯色結(jié)果和熒光結(jié)果一致,有熒光擴(kuò)增曲線且均產(chǎn)生綠色熒光,與對(duì)應(yīng)的熒光起峰一致。陰性未擴(kuò)增,顯色為無色,擴(kuò)增60min 60~65℃擴(kuò)增結(jié)果均可以用顯色法檢測(cè)。從實(shí)驗(yàn)熒光曲線Cq 值可知,61℃和62℃擴(kuò)增時(shí),雖然原始濃度的艱難梭菌DNA 模板更早開始擴(kuò)增,但是總體來看所有稀釋濃度的DNA 模板擴(kuò)增曲線,不如60℃擴(kuò)增效率高,顯色結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。65℃擴(kuò)增時(shí),稀釋濃度為8pg/μl、0.8pg/μl、0.08pg/μl、8fg/μl 均未擴(kuò)增,鈣黃綠素顯色也呈橙色,陰性,因此艱難梭菌LAMP 擴(kuò)增最佳溫度為60℃。
從Ct 值來看,每稀釋10 倍,分別約多出4 個(gè)、6 個(gè)、8 個(gè)、27 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)限為10倍稀釋,即使模板10倍稀釋(即0.8pg/μl)時(shí),Cq 值為87.15 個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)30s),相當(dāng)于44min,所以擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)控制為60min 時(shí),推測(cè)顯色檢測(cè)也是可行的。鈣黃綠素目測(cè)法及核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果均與擴(kuò)增曲線保持一致,即較早出現(xiàn)擴(kuò)增曲線的樣品呈綠色,核酸試紙條呈陽性。由敏感度實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,艱難梭菌tcdA 基因的檢出限為0.8pg/μl。
在優(yōu)化的LAMP 體系中對(duì)幾種腹瀉干擾菌進(jìn)行特異性檢測(cè),只有艱難梭菌可以檢測(cè)出陽性擴(kuò)增,鈣黃綠素目視法呈現(xiàn)熒光綠色,核酸試紙條也呈現(xiàn)出陽性,說明引物具有良好的特異性。
CD 是一種厭氧生長(zhǎng)的革蘭陽性梭狀產(chǎn)毒芽胞桿菌,廣泛分布于土壤、水等自然環(huán)境及人和動(dòng)物的糞便中,屬于條件致病菌。當(dāng)人體腸道菌群失調(diào)時(shí),艱難梭菌可大量繁殖,部分產(chǎn)毒性菌株通過 分泌毒素A、B 及二元毒素引起艱難梭菌感染(,CDI)及其相關(guān)性腹瀉(associated diarrhea,CDAD),甚至可能發(fā)展為危及生命健康的偽膜性腸炎。毒素A 具有腸毒素和細(xì)胞毒素,可使腸壁中性粒細(xì)胞釋放淋巴因子,引起黏膜炎性反應(yīng)。此外,毒素A 還能抑制wnt信號(hào)通路,具有抗腫瘤作用。
然而臨床上存在嚴(yán)重的廣譜抗生素頻繁使用以及不合理應(yīng)用等諸多問題,使得艱難梭菌感染的暴發(fā)流行概率大大增加。因此,能否對(duì)艱難梭菌感染進(jìn)行快速且特異的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),對(duì)于臨床診療至關(guān)重要。
目前對(duì)艱難梭菌感染進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)有CCTA、厭氧培養(yǎng)、EIA 和PCR 等4 種方法,它們都存在一定缺陷和局限性,如CCTA 的檢測(cè)結(jié)果受細(xì)胞種類的限制,操作復(fù)雜,費(fèi)用高,耗時(shí)長(zhǎng);厭氧培養(yǎng)法操作相對(duì)繁瑣,需時(shí)較長(zhǎng);EIA 敏感度差異較大,受多種條件的影響,PCR 分子水平檢測(cè)方法時(shí)間長(zhǎng),存在假陽性的情況。
LAMP 是一種在20 世紀(jì)90 年代核酸擴(kuò)增技術(shù)研究及應(yīng)用基礎(chǔ)上,逐漸被提出并廣泛應(yīng)用的一種新的技術(shù),該技術(shù)利用一種鏈置換DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件下保溫60min,即可完成核酸擴(kuò)增,具有快速高效,敏感度高,特異性高,操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),而且該技術(shù)不需要經(jīng)過模板的高溫變性和低溫退火過程。目前用于等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的方法主要有凝膠電泳、熒光染料、濁度法以及基于比色法的可視化檢測(cè)方法等。其中,凝膠電泳檢測(cè)操作繁瑣,持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),效率低;熒光法檢測(cè)需要特殊、昂貴的光學(xué)儀器;濁度法和比色法雖然用肉眼能夠觀察,但因觀察者的主觀判斷差異容易產(chǎn)生誤差,而且對(duì)核酸擴(kuò)增效率要求較高,并不適用于所有的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè),且儀器昂貴,也不適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本研究中針對(duì)艱難梭菌tcdA 基因核苷酸序列設(shè)計(jì)6 條特異性引物,建立了一種針對(duì)艱難梭菌tcdA 的LAMP 檢測(cè)方法。將LAMP 法結(jié)合核酸試紙條技術(shù),60℃擴(kuò)增1h,DNA檢出限為0.8pg/μl,敏感度高,速度快;在對(duì)1 株艱難梭菌和7 株非艱難梭菌進(jìn)行核酸檢測(cè)中,只有艱難梭菌陽性,證明設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性。
LAMP 結(jié)合核酸試紙條技術(shù)不需要復(fù)雜的儀器,只需在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增,再結(jié)合核酸試紙條的檢測(cè),無需開蓋引起氣溶膠污染,也不用辨別顏色差異,操作簡(jiǎn)便,耗時(shí)較短。本研究建立的艱難梭菌LAMP 擴(kuò)增結(jié)合核酸試紙條檢測(cè)方法1h 完成反應(yīng),具有可視化、敏感度高、特異性強(qiáng)、方便快捷和污染少等特點(diǎn),適用于糞便中艱難梭菌的快速檢測(cè),適用于基層醫(yī)院現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及應(yīng)用。