杜仲內(nèi)生真菌多樣性研究方法·應(yīng)用及展望

姚 婷，丁京燕，甘林端端，王 亞，徐源茹，張 娜，佘新松*

(1.黃山學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，安徽黃山 245041；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036；3.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山 245041)

植物內(nèi)生菌是存在于植物組織內(nèi)部并與宿主共生的真菌、細(xì)菌的統(tǒng)稱。這種長期共生過程不僅影響宿主植物的抗逆性、生物活性以及代謝物的積累，也會(huì)導(dǎo)致內(nèi)生菌產(chǎn)生一些與宿主植物相似甚至相同的次生代謝物。如冬蟲夏草內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)了苯甲醛類、環(huán)二肽類等冬蟲夏草的代謝物；海帶和銀杏的內(nèi)生菌中也分別檢測到類萜類和黃酮類、抗菌脂肽、球毛殼菌素等宿主的次生代謝產(chǎn)物。借助內(nèi)生菌可產(chǎn)生宿主相似或相同的次生代謝產(chǎn)物這一特點(diǎn)，以內(nèi)生真菌為原料開展新藥篩選、農(nóng)藥活性物質(zhì)提取等研發(fā)，從而解決以昂貴稀少又難以獲取的宿主為原料的難題。相對于內(nèi)生細(xì)菌而言，內(nèi)生真菌具有分離容易、生長速度快、培育條件低、次生代謝產(chǎn)物較多、后期處理相對方便等優(yōu)點(diǎn)而成為內(nèi)生菌的研究重點(diǎn)。

杜仲(Oliv.)起源古老，是我國的第三紀(jì)孑遺植物，在《中國植物紅皮書-稀有瀕危植物》(第一卷)被列入為珍稀瀕危第二類的保護(hù)樹種。自1955年召開的第一次杜仲藥理國際研討會(huì)正式公布了杜仲的降低血壓研究成果之后，國內(nèi)外的相關(guān)專家相繼開展了有關(guān)杜仲的大量研究和臨床試驗(yàn)。20世紀(jì)80—90 年代我國開啟了起杜仲消費(fèi)熱潮，杜仲的需求量激增，然而杜仲的生長周期較長，剝皮藥用的杜仲則需生長 15～20 年。在市場驅(qū)動(dòng)下大量非理性杜仲剝皮事件時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重破壞了杜仲資源。

杜仲內(nèi)生真菌多樣性豐富，且不同部位和季節(jié)杜仲內(nèi)生真菌也存在明顯差異。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)杜仲內(nèi)生真菌中含有與杜仲的代謝產(chǎn)物和活性物質(zhì)一致的多種成分，如丁婷等從杜仲內(nèi)生真菌發(fā)酵液中檢測到多糖等與宿主相同的藥效成分。杜仲內(nèi)生真菌還有對多種病原菌有抑菌作用的成分，如王麗麗等分離出的41株杜仲內(nèi)生真菌中大部分對黃瓜炭疽病、西瓜枯萎病等多種病原菌有拮抗作用，李雅等分離得到的49株杜仲內(nèi)生真菌，約有45%對蘋果腐爛病菌、番茄灰霉病菌等測試菌有抑制作用。

因此，從杜仲資源的開發(fā)與保護(hù)來看，杜仲內(nèi)生真菌的合理利用，不僅可以有效地保護(hù)杜仲資源，也不影響杜仲藥用功能的開發(fā)利用。該研究基于現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，對杜仲內(nèi)生真菌的多樣性進(jìn)行綜述，闡述了杜仲內(nèi)生真菌的相關(guān)研究方法、應(yīng)用及前景，以期為杜仲內(nèi)生真菌的研究和開發(fā)提供參考。

1 杜仲內(nèi)生真菌多樣性

杜仲內(nèi)生真菌的種類較為豐富，表1顯示杜仲內(nèi)生真菌共有4門，12綱，21目，26科，40屬。屬于子囊菌門的內(nèi)生真菌有33屬，占總屬數(shù)的82.5%，而屬于擔(dān)子菌門、卵菌門和毛霉門的內(nèi)生真菌分別只有2、1和1屬，僅占總屬數(shù)的5.0%、2.5%和2.5%；屬于糞殼菌綱、座囊菌綱、散囊菌綱、錘舌菌綱、絲孢綱和腔孢綱的內(nèi)生真菌分別有11、8、4、3、3和2屬，占總屬數(shù)的27.5%、20.0%、10.0%、7.5%、7.5%和5.0%，而屬于傘菌綱、黑粉菌綱、盤菌綱、茶漬綱、卵菌綱和毛霉菌綱的內(nèi)生真菌均只有1屬，分別僅占總屬數(shù)的2.5%；屬于亞隔孢殼科、從赤殼科、間座殼科、曲霉科和白粉菌科的內(nèi)生真菌分別有3、2、2、3和2屬，占總屬數(shù)的7.5%、5.0%、5.0%、7.5%和5.0%，而其他的科都只有1個(gè)屬?？傮w來看，杜仲內(nèi)生真菌以子囊菌門為主，以座囊菌綱和糞殼菌綱為優(yōu)勢綱，也有少量為擔(dān)子門、卵菌門和毛霉門真菌。

表1 杜仲內(nèi)生真菌的分類Table 1 Classification of endophytic fungi of Eucommia ulmoides

杜仲的不同部位內(nèi)生真菌在數(shù)量和種類存在明顯差異，表現(xiàn)出不同部位和器官的內(nèi)生真菌多樣性的異質(zhì)性。孫微微等和丁婷等從杜仲健康的莖、葉和果實(shí)中共分離得到32株內(nèi)生真菌，3種部位分離菌株數(shù)量依次為9、14、9株，在葉部位中真菌分離率最高且種類最豐富。馬養(yǎng)民等從杜仲根、莖和葉部位中共分離出62株內(nèi)生真菌，3種部位分離內(nèi)生真菌的數(shù)量依次為20、21和21株。Sun等從杜仲中共分離內(nèi)生真菌為307株，其中杜仲葉中僅有12株，而在1～3年枝中共分離發(fā)現(xiàn)了295株。

杜仲不同部位內(nèi)生真菌分離試驗(yàn)結(jié)果表明，枝部中內(nèi)生真菌種數(shù)顯著多于根、莖、葉和果實(shí)等部位的內(nèi)生真菌。在杜仲內(nèi)生真菌開發(fā)和利用中，需要考慮不同部位的內(nèi)生真菌多樣性的差異，選取特定部分進(jìn)行分離培養(yǎng)。

杜仲內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量在月、季間存在一定的差異性，表現(xiàn)出內(nèi)生真菌多樣性的時(shí)序動(dòng)態(tài)特征。楊明琰等在春季和秋季杜仲莖部分別分離得到26株5個(gè)屬和38株9個(gè)屬內(nèi)生真菌，同時(shí)秋季杜仲內(nèi)生真菌數(shù)量和種類均高于春季。梁雪娟利用Simpson優(yōu)勢度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和 Pielou均勻度指數(shù)等指標(biāo)分析了杜仲皮的內(nèi)生真菌多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)季節(jié)對杜仲皮部內(nèi)生真菌種群影響較大，如頭年11月和翌年1月杜仲皮內(nèi)生真菌種群多樣性豐富，且分布較均勻，而3月和7月優(yōu)勢菌群集中，種群較單一。

生境是影響真菌生長、發(fā)育的重要因素，不同季節(jié)的氣候差異較大，從而形成了不同的生境。在季節(jié)性生境差異的影響下，杜仲內(nèi)生真菌的種屬和數(shù)量也有明顯的差異，表現(xiàn)為杜仲內(nèi)生真菌時(shí)序多樣性特征。在季節(jié)性氣候因子中，如最小相對濕度、降雨、平均濕度和平均溫度等這些與真菌較為敏感的濕度和溫度因子尤其關(guān)鍵。

內(nèi)生真菌與宿主植物在長期共生演化過程中，通過生物化學(xué)作用，使得內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物也呈現(xiàn)出一定的多樣性。目前已在杜仲內(nèi)生真菌中檢測出多種的具有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。如在杜仲樹皮部的內(nèi)生真菌中分離出松脂醇二葡萄糖苷、根莖葉部內(nèi)生真菌中篩選出黃酮類化合物、松脂醇二葡萄糖苷等多種重要的藥用化合物。

龔倩玉等從杜仲內(nèi)生真菌分離出了吡喃酮類、聚酮類、嘧啶類和苯的衍生物等15種次生代謝物質(zhì)，以及具有抗菌活性的Azaphilones類化合物。Liu等除從杜仲內(nèi)生真菌中分離10種已知化合物外，還檢測到asperflaloids A和asperflaloids B等2種生物堿。田從麗在杜仲內(nèi)生真菌中分離得到正丁基-β-D-吡喃果糖苷、甘露醇、啤酒甾醇和麥角甾醇等4個(gè)化合物。Liu等從杜仲樹皮的青霉()中分離得到conioxepinol C、大黃素、moniliphenone、penicichromanone A和penicichromanone B等5種化合物。Zhang等從杜仲內(nèi)生真菌(sp.)中分離出了麥角固醇、啤酒甾醇、尿囊素、殺錐曲菌素等9種次生代謝產(chǎn)物。Ma等從分離自杜仲的內(nèi)生真菌(sp.)中分離得到煙曲霉毒素B、煙曲霉素C、麥角甾醇、啤酒甾醇等。

杜仲內(nèi)生真菌除了部位、時(shí)序和代謝產(chǎn)物多樣性外，杜仲內(nèi)生真菌多樣性還受到采集地域、杜仲生長年齡、培育方式等因素的影響。

2 杜仲內(nèi)生真菌研究方法

利用微生物的抗菌作用和抑菌作用是病蟲害生物防治的重點(diǎn)方向之一。利用杜仲內(nèi)生真菌的抗菌和抑菌作用，在篩選抗菌作用和抑菌效果明顯的菌株，是近年來對杜仲內(nèi)生真菌資源進(jìn)行的開發(fā)利用的方向之一。目前，較為常用的杜仲抗菌型內(nèi)生真菌的篩選方案和步驟主要有以下兩類：

(1)分離和純化→菌株篩選→分子鑒定。分離采用組織分離法，純化采用尖端菌絲挑取法，菌株篩選采用平板對峙法做生防菌和病原菌間的拮抗試驗(yàn)，分子鑒定以CTAB法提取菌株基因組DNA，獲取ITS序列，經(jīng)對比、分析和鑒定，最后確定具有抗菌作用的目標(biāo)菌株。

(2)分離和純化→形態(tài)學(xué)鑒定→次生代謝產(chǎn)物提取→抑菌試驗(yàn)。杜仲內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定主要參照《真菌鑒定手冊》，可采用光學(xué)顯微鏡技術(shù)、掃描電鏡技術(shù)或透射電子顯微鏡技術(shù)，依據(jù)真菌的形態(tài)、理化性能及超微特征等表型特征進(jìn)行初步分類。

光學(xué)顯微鏡技術(shù)是根據(jù)內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基的生長速度、大小、菌落紋飾、質(zhì)地、邊緣等培養(yǎng)特征進(jìn)行分類，一般將菌絲用透明膠帶粘貼，鏡檢觀察其分生孢子梗和孢子的形態(tài)及大小等顯微特征。

掃描電鏡技術(shù)是采用插片法培養(yǎng)菌株，待菌絲長滿玻面后取出，在緩沖液中戊二醛固定樣品超過4 h，3次洗滌，四氧化鋨再固定1 h，3次洗滌。樣品通過設(shè)置梯級濃度的乙醇脫水15～20 min，轉(zhuǎn)移到乙醇和乙酸異戊酯的混合液約0.5 h，再經(jīng)純乙酸異戊酯浸泡1 h后干燥，樣品表面涂金，掃描顯微鏡觀察，可清晰地分辨出真菌的菌絲、大分生孢子和小分生孢子。

透射電子顯微鏡技術(shù)是在培養(yǎng)皿中依次鋪濾紙和銅網(wǎng)膜，注入無菌水，滴入火棉膠液(2 g火棉膠/100 mL醋酸異戊酣)，薄膜形成后吸管在吸干培養(yǎng)皿的邊緣處水分，至薄膜貼緊銅網(wǎng)止，室溫干燥毛細(xì)管吸取菌液并滴在銅網(wǎng)上，透射電子顯微鏡下觀察或攝影。

抑菌試驗(yàn)采用菌餅法測定活菌活性、紙片擴(kuò)散法(活菌測試)測定代謝產(chǎn)物活性(代謝物測試)。

總體來看，基于電鏡等先進(jìn)設(shè)備進(jìn)行的形態(tài)學(xué)鑒定，在杜仲內(nèi)生真菌的篩選上盡管試驗(yàn)步驟較為復(fù)雜，但篩選的結(jié)果更為精確。隨著先進(jìn)的技術(shù)設(shè)備在真菌篩選上的應(yīng)用，杜仲內(nèi)生真菌的分離、篩選的分辨率將不斷提高。

3 杜仲內(nèi)生真菌的應(yīng)用

杜仲化學(xué)成分豐富，主要有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、酚類、甾類、萜類、多糖類、杜仲膠等，具有心血管保護(hù)、抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等保健作用，且應(yīng)用價(jià)值高，有著生態(tài)價(jià)值、飼用價(jià)值、食用價(jià)值和工業(yè)價(jià)值等。隨著杜仲的化學(xué)成分和藥理活性研究的逐步深入，其應(yīng)用日益廣泛且市場需求也隨之增大，因此尋找替代物刻不容緩，這讓杜仲內(nèi)生真菌具有廣闊的發(fā)展前景。

杜仲內(nèi)生真菌的培養(yǎng)可起到代替藥用植物的作用，在醫(yī)療上有著可觀的應(yīng)用潛力。Chen等利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了杜仲內(nèi)生真菌產(chǎn)生了相關(guān)的綠原酸和京尼平苷成分，并認(rèn)為杜仲內(nèi)生真菌有利于發(fā)酵生產(chǎn)綠原酸這一重要活性成分。劉超等從杜仲樹皮的內(nèi)生真菌中提取到了松脂醇二葡萄糖，表明杜仲內(nèi)生真菌在生產(chǎn)松脂醇二葡萄糖有一定的開發(fā)前景。程浩等以1株杜仲內(nèi)生真菌為研究對象，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵松脂醇二葡萄糖苷工藝條件，為其規(guī)?；a(chǎn)提供了重要參考。Wu等對杜仲降壓成分京尼平苷和京尼平苷酸的提取工藝做出比較，得出半仿生提取法為最佳方案，有利于進(jìn)行高效及大規(guī)模生產(chǎn)。岑娟等將杜仲產(chǎn)生的多糖成分進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性篩選，發(fā)現(xiàn)其對部分腫瘤細(xì)胞有著一定的細(xì)胞毒作用。Zhang等從杜仲的內(nèi)生真菌ER16-5中分離出7種膠霉毒素類似物，其中膠霉毒素和脫氫膠霉毒素顯示強(qiáng)大的抗菌性，表明該菌株是前景極好的抗菌次生代謝產(chǎn)物來源。

近年來，普通農(nóng)藥被廣泛使用于農(nóng)作物的病蟲害，造成了環(huán)境污染及蔬菜水果的農(nóng)藥殘留問題，相比之下，杜仲內(nèi)生真菌的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)的生物防治方面有著更加積極的作用。丁婷等分離出1株杜仲內(nèi)生真菌DZGS08，對玉米紋枯病菌生長抑制率達(dá)到了50.44%。孫微微等從杜仲中分離出內(nèi)生真菌 DZGS07，對蘋果炭疽菌處理后的第7天的防效高達(dá)84.19%，有著較好的生防潛力。丁婷等將具有較好抑菌活性的杜仲內(nèi)生真菌的抗性突變株株 DZJ07-2定植在小麥根際，提高了小麥根部3種防御酶的活性，使得小麥對紋枯病的抗性得到一定程度上的提高。

4 展望

在杜仲資源有限而市場需求持續(xù)增加的背景下，科學(xué)開發(fā)和有效利用杜仲內(nèi)生真菌資源將是當(dāng)下杜仲資源研究的重點(diǎn)方向。杜仲內(nèi)生真菌多樣性不僅提供了大量可用于新藥篩選、開發(fā)的微生物資源，且其代謝物也可用于藥物開發(fā)和篩選抗菌菌株，顯示其在藥物研發(fā)和生防上具有巨大潛力和應(yīng)用前景。盡管前期在杜仲內(nèi)生真菌領(lǐng)域開展了大量的研究，也取得了諸多研究進(jìn)展，但依舊存在以下問題亟待解決。第一，杜仲內(nèi)生真菌的分離與鑒定方法缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，研究結(jié)果的可比性差，需要進(jìn)一步開展杜仲內(nèi)生真菌的分離、鑒定方法優(yōu)化的研究；第二，內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物與杜仲之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)研究較少，特別是杜仲-內(nèi)生真菌-代謝產(chǎn)物之間信號(hào)傳遞和響應(yīng)機(jī)制等機(jī)理研究有待深入；第三，影響杜仲內(nèi)生真菌多樣性的因素復(fù)雜，對宏觀環(huán)境要素、微觀生境、生長期、組織器官的部位等諸多因素的貢獻(xiàn)還有待明確；第四，杜仲內(nèi)生真菌在醫(yī)療制藥和農(nóng)業(yè)生物防治方面的應(yīng)用缺乏實(shí)踐，距離大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還很遠(yuǎn)；第五，杜仲膠在工業(yè)橡膠上有著巨大的應(yīng)用市場，利用內(nèi)生真菌促進(jìn)杜仲的產(chǎn)膠率和提取率也是值得探索的方向。