微生物快速檢驗技術(shù)的應(yīng)用進展研究

周宇軒，全穎瑩

1.阿克蘇地區(qū)疾病預(yù)防控制中心 檢驗科，新疆 阿克蘇 843000；2.阿克蘇地區(qū)疾病預(yù)防控制中心 性病/艾滋病科，新疆 阿克蘇 843000

0 引言

隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，常規(guī)的檢驗技術(shù)所需時間比較長，再加上操作工序較多，檢查特異性比較低，進而影響實際的檢驗結(jié)果，不適用于實際檢測。一種全新的微生物檢測技術(shù)應(yīng)時而生，該技術(shù)具有更加精準的、快速、可靠的優(yōu)勢，具有更高的應(yīng)用價值。隨著感染疾病的人數(shù)顯著增多，需發(fā)現(xiàn)更加有效的檢測技術(shù)，進而制定研制合理的治療藥物，對患者進行有效的治療，保證患者的療效。

1 微生物形態(tài)學(xué)檢驗的質(zhì)量控制

近幾年，隨著豬鏈球菌以及禽流感疾病的流行發(fā)展，患有感染性疾病的人群逐漸增多[1]。然而，感染性疾病患者的確診除了需要根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)之外，還需要一系列的臨床醫(yī)學(xué)病原微生物診斷作為依據(jù)。所以，科學(xué)、合理用疾控中心檢驗科內(nèi)的微生物形態(tài)學(xué)，精準的檢驗結(jié)果對患者疾病的診斷具有十分重要的意義。微生物形態(tài)學(xué)檢驗技術(shù)作為一種臨床診斷方法，在感染性疾病患者的臨床診斷中具有無可替代的作用。但是，由于對患者進行微生物形態(tài)學(xué)檢驗，時常受到多種內(nèi)部因素一些外在因素產(chǎn)生的干擾，致使檢驗技術(shù)人員無法獲得精準、可靠的檢測報告，從而影響患者疾病診斷的準確性。因此，疾控中心為生物形態(tài)學(xué)檢驗需要加強質(zhì)量控制，從而保證最終診斷結(jié)果的精準性，其主要包含以下幾個方面：

（1）標本采集。檢驗科室人員采集合格的標本，是保證最終檢驗結(jié)果準確的首要條件[2]。工作人員在采集檢驗標本時，需要嚴格按照國家以及衛(wèi)生部的相關(guān)標準，并在保存、運送等各個環(huán)節(jié)內(nèi)，根據(jù)標本存在的差異進行管理。此外，微生物形態(tài)學(xué)檢驗科室人員需要明確掌握自己購買的培養(yǎng)基、診斷血清以及染色液等檢驗試劑，是否符合相關(guān)的標準、在有效期內(nèi)可以正常應(yīng)用于微生物檢驗中，從而保證最終檢驗出的結(jié)果精準、可靠。

（2）檢驗人員的技術(shù)。微生物形態(tài)學(xué)主要是一種以定性實驗為主，且無法使用機械替代傳統(tǒng)手工操作的一種中高難度復(fù)雜臨床檢驗。這就需要微生物檢驗技術(shù)人員需要具有較高的檢驗技術(shù)以及專業(yè)素養(yǎng)，從而展開一系列合格科學(xué)的臨床檢驗[3]。對于部分技術(shù)能力不足、專業(yè)素養(yǎng)較低的檢驗工作人員，檢驗科室需要對其展開嚴格的培訓(xùn)工作并定期展開考核，從而提高檢驗科室人員的專業(yè)技能以及素養(yǎng)，促使檢驗工作人員可以嚴格按照相關(guān)標準進行檢驗工作。檢驗科室通過培訓(xùn)考核等措施，可以提高工作人員的檢驗操作能力，并正確填寫臨床檢驗結(jié)果，幫助患者更好地診斷疾病[4]。除此之外，微生物形態(tài)學(xué)檢驗人員還需加大工作檢查力度，并針對檢驗工作人員工作中存在的問題進行糾正，最大限度地減少由于工作技術(shù)人員操作不當(dāng)而出現(xiàn)的檢驗誤差，充分保證檢驗結(jié)果的準確性。

（3）檢驗方法。在進行平行樣檢驗測定時，需要保證獲取到的結(jié)果具有可比性。檢驗人員需要設(shè)置一個空白的對照組，從而排除其他的因素，比如標本污染等可能導(dǎo)致最終檢驗結(jié)果出現(xiàn)偏差的因素，有效保證檢測結(jié)果的準確性。檢驗技術(shù)員需要擬定檢驗質(zhì)量控制相關(guān)內(nèi)容，并制定相關(guān)規(guī)范化的標準要求，嚴格按照這些要求展開件工作[5]。

2 傳統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)分析

在微生物檢驗領(lǐng)域中，一般的檢驗項目包括菌落總數(shù)計數(shù)檢驗、霉菌計數(shù)檢驗、酵母菌計數(shù)檢驗、大腸菌群計數(shù)檢驗以及常見致病菌的檢驗。傳統(tǒng)的檢驗方法主要包括微生物形態(tài)學(xué)檢查、噬菌體分型檢驗、毒性試驗及生化試驗等。一般的試驗方法包括明膠試驗、氧化酶試驗、糖酵解試驗等等。這些較為傳統(tǒng)的微生物檢驗技術(shù)可以達到微生物檢驗的目的，但在實踐過程中還是表現(xiàn)出一些局限性和不足之處。如試驗操作難度較大、試驗步驟較為煩瑣等，且淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗等較為傳統(tǒng)的微生物檢驗方法具有檢驗周期較長的特點，通常需要2～14d之間可以完成檢驗，實時性較差。

在一些產(chǎn)品檢驗和生產(chǎn)工藝檢驗環(huán)節(jié)中，基于傳統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)很難及時反饋檢驗結(jié)果，無法迅速采取應(yīng)對和改進措施。以單核細胞增生李斯特氏菌檢驗為例，傳統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)包含微生物增菌、微生物分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)及溶血試驗、動物試驗等多項操作，這些試驗對于試驗儀器設(shè)備的要求并不高，常規(guī)實驗室即可完成微生物檢驗過程，具有較強的可操作性，但實施微生物檢驗的時間較長，大概需要14d。受到傳統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)的制約，在一些可以物品中分離特定致病菌的難度較大，很多食源性中毒事件往往在中毒事件發(fā)生后很久才能進一步確定致病的食品。故上述傳統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)已很難滿足微生物在線檢驗及微生物快速檢驗的需求。在這一背景下，就要求相關(guān)檢測機構(gòu)積極引入微生物快速檢驗技術(shù)。

3 微生物快速檢測應(yīng)用推廣的必要性

現(xiàn)階段，飲食安全及用藥安全問題越來越受到關(guān)注，因微生物污染所致的食品安全事件和藥品安全事件更是受到媒體平臺和廣大人民群眾的廣泛關(guān)注。為了減少飲食用藥安全事件的發(fā)生就需要采用科學(xué)、合理的方法對相關(guān)產(chǎn)品進行微生物檢驗。傳統(tǒng)微生物檢驗方法雖然有著較強的可操作性，一般檢驗檢測機構(gòu)均能完成檢驗，但檢驗所消耗的時間周期較長，想要獲得精準檢驗結(jié)果對相關(guān)檢驗人員的技術(shù)水平有著較高要求。故急需建立微生物快速檢驗方法，及時、準確地反饋相關(guān)產(chǎn)品和具體生產(chǎn)工藝中的微生物現(xiàn)狀。伴隨科技水平的提升，很多微生物快速檢驗技術(shù)已被成功開發(fā)并獲得廣泛應(yīng)用，其中很多微生物快速檢驗技術(shù)具有實時監(jiān)控或近實時監(jiān)控微生物的能力，能夠更好的反饋和監(jiān)控微生物情況，有助于縮短微生物檢驗的時間，進而提高微生物檢驗的整體效率。與此同時，以微生物快速檢驗技術(shù)替代傳統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)，能夠增加相關(guān)檢測機構(gòu)對微生物檢驗技術(shù)的理解和監(jiān)控，有利于提高相關(guān)檢測機構(gòu)的運行效率。

4 微生物快速檢測的研究進展

4.1 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)中包含酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)以及免疫層析技術(shù)。首先，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)主要是指將已經(jīng)知曉的抗原或者抗體吸附在聚苯乙烯的微量反應(yīng)板上或者其他的固定載體表面，并使用酶標記過的抗原抗體在含有聚苯乙烯的微量反應(yīng)板上或者其他的固定載體表面進行反應(yīng)，并在其反應(yīng)之后將液體中存在的游離成分進行洗滌以及消除[6]。這一操作就是快速檢測方法張紅的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)基本實驗方法，且在這一實驗過程中選擇使用的方法，包含雙抗體夾心法以及間接法。雙抗體夾心法主要是指對一些大分子抗原進行檢測的內(nèi)容榮，而間接法則常被用于檢測異抗體。這還是由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在當(dāng)前的微生物檢測中十分常見，其具有靈敏程度比較高、檢測速度比較快的優(yōu)勢[7]。其次，免疫層析技術(shù)的檢測步驟常是將檢驗的標本放置在條狀的纖維膜上，讓其通過充分涌動之后，使用層析以及免疫反應(yīng)的雙重作用，促使檢測樣本可以在含有配體的纖維膜上充分顯現(xiàn)，并通過著色標記對其中包含的微生物進行詳細的分析工作。免疫層析技術(shù)作為免疫學(xué)技術(shù)的根本技術(shù)部分，其常被用于食物微生物檢測過程中。臨床檢測人員 通過免疫層析技術(shù)可以使用掃描儀器設(shè)備對樣本進行掃描，基本在10分鐘左右就可以完成檢測工作，其具有檢測效率比較高、消耗時間比較少的特點，更是被廣泛應(yīng)用于臨床中[8]。

4.2 代謝學(xué)技術(shù)

代謝學(xué)技術(shù)主要是指通過對人體脫氧核糖核酸進行天然的復(fù)制工作之后，對體位的脫氧核糖核酸分子擴增的一種分子生物學(xué)技術(shù)，其也被稱為單鏈構(gòu)態(tài)多項性分析技術(shù)。單鏈構(gòu)態(tài)多項性分析技術(shù)的主要檢測作用，就是通過擴增位于人體兩段一直序列之間的脫氧核糖核酸區(qū)域段，并在等待擴增的脫氧核糖核酸片段兩側(cè)和期周圍兩側(cè)產(chǎn)生互補的兩個寡核苷酸引物，其經(jīng)過變性、退火以及延伸等多個不同的循環(huán)之后，脫氧核糖核酸可以擴增2倍左右[9]。并且，作為代謝學(xué)檢測技術(shù)的基本部分之一，也是保證食品微生物檢測結(jié)果合理、科學(xué)的根本技術(shù)，其常被應(yīng)用于當(dāng)代的食品微生物檢驗測試中。微生物快速檢驗中的代謝學(xué)方法主要包括電阻抗法與ATP生物熒光法等。

其中電阻抗法是利用電阻抗技術(shù)和電容分析技術(shù)進行微生物總數(shù)的測定。因微生物在進行新陳代謝時可產(chǎn)生大量電解質(zhì)，不同微生物所產(chǎn)生電解質(zhì)的水性有所不同，故將微生物置于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間后，培養(yǎng)基中所加入的電惰性底物在微生物的新陳代謝下會轉(zhuǎn)化成活性底物，進而增強了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，使得培養(yǎng)基的電阻抗值降低，故可基于電阻抗法快速檢驗微生物的總數(shù)。電阻抗法用于微生物檢驗具有敏感性好、特異性強、重復(fù)性好、反應(yīng)迅速等優(yōu)勢，是目前微生物快速檢驗中廣泛使用的方法之一。

ATP生物熒光法在微生物快速檢驗中的應(yīng)用也十分廣泛，ATP即三線酸腺苷，能夠為活體細胞各項生命活動提供能量，該物質(zhì)存在于所有生命體當(dāng)中并且含量較為穩(wěn)定。因細菌細胞內(nèi)ATP在細胞死亡后數(shù)分鐘內(nèi)就會被水解進而小時，故基于ATP生物熒光法檢測能夠間接地證明生命體的存在。該技術(shù)利用螢光素酶，將ATP、D-熒光素、氧氣作為底物，當(dāng)存在Mg2+時螢光素酶可催化熒光素的氧化進而釋放出熒光，基于熒光檢測系統(tǒng)對發(fā)光值進行檢測，即可進一步推算受檢物質(zhì)中所含微生物的數(shù)量。該技術(shù)具有簡單快捷、靈敏度高的優(yōu)勢，能夠省略微生物檢驗中的微生物培養(yǎng)環(huán)節(jié)，能夠大大縮短微生物檢驗的時間，減少微生物檢驗的生物。目前ATP生物熒光法在基礎(chǔ)生物學(xué)、微生物快速檢驗等領(lǐng)域已獲得廣泛應(yīng)用。由于ATP生物熒光法屬于一種非破壞性的方法，經(jīng)ATP生物熒光法檢測的微生物能夠繼續(xù)按照傳統(tǒng)微生物檢驗方法進行培養(yǎng)，開展后續(xù)的分析檢驗和溯源，故其應(yīng)用前景十分廣闊。

4.3 分子生物技術(shù)

隨著當(dāng)代臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)更是被廣泛使用于食物微生物檢測工作中。而分子生物學(xué)的基因芯片技術(shù)主要是指食品微生物檢測過程中的實際效果比較好，其針對一些特異性的微生物檢測，具有較高的檢測價值以及作用[10]。檢測人員在使用分子生物技術(shù)進行食品檢測之前，需要對分子芯片中的寡核苷酸物質(zhì)進行提取工作，并在提取成功之后將其歸納為脫氧核糖核酸的擴列中。此外，檢測人員低實際檢測過程中的微生物進行熒光標記，可以將實驗標準作為根本的依據(jù)，并對其實際數(shù)據(jù)進行相關(guān)的融合。當(dāng)檢測人員做好各項準備工作之后，可以在實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)食物樣本中存在的微生物檢測結(jié)果，同時對比各項數(shù)據(jù)展開分析，最終判定食物是否符合食用標準，從源頭上杜絕不合格的食物流入市場中[11-12]。

4.4 傳感器檢測方法

傳感器檢測方法主要包含基因傳感器以及生物傳感器?；騻鞲衅髦饕菍煞N不同的脫氧核糖核酸相結(jié)合，并對脫氧核糖核酸分子鏈進行物理信號的接受以及傳遞，最終通過換能器的形式對其進行展現(xiàn)，其也是基因傳感器的使用基本原理。及基因傳感器具有操作便捷、檢測時間較短等優(yōu)勢，其在食物微生物檢測中具有十分重要的作用。而生物傳感器主要是指將被測分子和敏感材料的特異性相結(jié)合，在二者發(fā)生結(jié)合后將各種信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，是其進行工作的基本原理[13-14]。生物傳感器以傳感技術(shù)、生物化學(xué)作為基礎(chǔ)，以酶、核酸、抗原及抗體等固化生物敏感材料作為微生物的識別元件，輔以信號轉(zhuǎn)換器、放大器所組成的分析系統(tǒng)，當(dāng)檢測物質(zhì)進入識別元件后一旦與識別元件發(fā)生特異性結(jié)合就會進一步產(chǎn)生生物活性表達信號，信號轉(zhuǎn)化器將這些生物活性表達信號轉(zhuǎn)換為電信號，信號放大器將這些電信號放大并輸出后即可用電化學(xué)方法準確進行微生物快速檢測。生物傳感器因?qū)Ｒ恍詮?、靈敏度高、檢驗程度較低，并且能夠?qū)崿F(xiàn)自動化、微型化、集成化的快速檢驗，可在較為復(fù)雜的體系中進行在線連續(xù)微生物檢測，故在近年微生物快速檢驗領(lǐng)域獲得了十分迅速的發(fā)展。

5 結(jié)論

綜上所述，隨著我國科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，快速檢測技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于臨床檢測工作中，而工作人員更需在實際工作中提升自身的能力素質(zhì)，從而根據(jù)食品不同的種類以及內(nèi)容，選擇合理的快速檢測方法，充分保證人們的飲食安全。并且，食品安全是一個關(guān)系到我國人類健康以及國計民生的主要問題。隨著食物的種類逐漸增多、食物成分越來越復(fù)雜，不同的食物中都存在著一定影響檢測的因素，所以當(dāng)前大部分快速檢測工作依然處于實踐過程中，部分檢測的結(jié)果也常被當(dāng)作一個參考內(nèi)容。因此，人們需要研究出更多快速、便捷的食品微生物檢測方法，從而滿足人們的食品安全需求，為人們的公共衛(wèi)生以及健康提供良好的保證。