PD-L1與APE1在乳腺癌組織中的表達(dá)及與其預(yù)后的相關(guān)性

梁曉丹 馮凱祥 張 強(qiáng) 柴麗君

乳腺癌屬于常見惡性腫瘤之一，女性人群中此類疾病占據(jù)首位，嚴(yán)重威脅女性生命安全[1]。對(duì)于免疫檢查點(diǎn)的抑制劑，比如程序性死亡受體1/程序性死亡配體1(PD-1/PD-L1)，在多種腫瘤疾病中均具有一定效果[2]。在某人的研究中[3]，研究發(fā)現(xiàn)在胃癌患者中，PD-L1及脫嘌呤/脫嘧啶內(nèi)切核酸酶1(APE1)表達(dá)水平異常上升，胃癌患者的預(yù)后越差，初步表明PD-L1及APE1異常表達(dá)可能與腫瘤患者不良預(yù)后存在關(guān)系。本次研究旨在探討PD-L1及APE1蛋白與乳腺癌相關(guān)性及其臨床意義，為進(jìn)一步明確PD-L1及APE1參與乳腺癌發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2017年1月至2019年1月在我院就診的乳腺癌患者98例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合2019版中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌專業(yè)委員會(huì)制定的《中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范》中關(guān)于乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②納入本次研究1年內(nèi)均未服用過影響PD-L1與APE1蛋白表達(dá)的藥物；③病理資料均完整；④均為女性患者；⑤手術(shù)治療之前均未接受手術(shù)或者放化療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往存在精神疾病史者；②意識(shí)障礙患者；③合并其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)類疾病史；④合并腎臟類、肝臟等重要疾病史者。獲取98例乳腺癌組織標(biāo)本，同時(shí)獲取本次研究對(duì)象遠(yuǎn)離癌組織5 cm以外的癌旁組織98例。年齡24～76歲，平均年齡(56.39±3.55)歲；病程2～6年，平均病程(3.17±0.31)年；組織學(xué)分級(jí)：低度分化28例，中度分化45例，高度分化25例；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌63例，腺細(xì)胞癌35例；臨床分期：Ⅰ期46例，Ⅱ期19例，Ⅲ期～Ⅳ期33例。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 ①乳腺癌組織：采用乳腺癌根治術(shù)，手術(shù)過程中切除患者病灶組織。②癌旁組織：距離乳腺癌患者病灶組織5 cm以外的正常組織。獲取上述組織，加入4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，約24～48 h以后，加入乙醇脫水，再加入甲苯溶液，石蠟包埋處理。

1.2.2 主要儀器與試劑 ①主要儀器：高倍鏡(上海尖端光電科技有限公司，MS-02)；②主要試劑：PD-L1、APE1蛋白多克隆抗體(北京啟維益成科技有限公司試劑部，Arabidopsis thaliana)；DAB顯色劑及配套試劑盒(南京肽業(yè)生物科技有限公司)；枸櫞酸(南京化學(xué)試劑股份有限公司)；3%過氧化氫溶液(上海雅吉生物科技有限公司)；山羊血清(山羊血清)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)乳腺癌組織及癌旁組織中PD-L1、APE1蛋白表達(dá) 獲取上述保存的組織，切片，4 μm即可，加枸櫞酸修復(fù)抗原，再加3%過氧化氫溶液(H2O2)，接著加入山羊血清，封閉，半小時(shí)后，分別加一抗抗體(比例均為1∶200PD-L1、APE1)，4 ℃孵育，過夜，再加入二抗抗體(1∶1000)，孵育，半小時(shí)后，二氨基聯(lián)苯胺溶液(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片，電鏡觀察。PD-L1、APE1染色后呈現(xiàn)棕黃色顆粒表示為陽性。高倍鏡觀察，陰性：陽性細(xì)胞數(shù)<10%；陽性：陽性細(xì)胞數(shù)≥10%。顯色程度評(píng)分：0分表示無色；1分表示黃色；2分表示棕黃色；3分表示棕褐色；基于陽性細(xì)胞占比評(píng)分，0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞占比<25%，2分為陽性細(xì)胞占比25%～50%，3分為陽性細(xì)胞占比50%～75%。將上述兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)乘機(jī)作為總分，總分≥3分表示陽性。

1.3 隨訪

以門診或者電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪24個(gè)月，記錄累積生存率。與乳腺癌疾病無關(guān)的患者出現(xiàn)死亡納入截尾事件。

1.4 觀察指標(biāo)

PD-L1、APE1蛋白陽性率；PD-L1、APE1蛋白與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系；PD-L1、APE1蛋白與乳腺癌患者2年生存情況的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中PD-L1、APE1蛋白陽性率比較

癌組織中PD-L1、APE1蛋白陽性率分別為30.61%、57.14%，均顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織及癌旁組織中PD-L1、APE1蛋白陽性率比較(例，%)

2.2 PD-L1、APE1蛋白與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同腫瘤大小、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同腫瘤分期、不同Ki-67表達(dá)的乳腺癌患者PD-L1蛋白表達(dá)陽性率比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同組織學(xué)分級(jí)及不同Ki-67表達(dá)的乳腺癌患者APE1蛋白表達(dá)陽性率比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他臨床病理參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 PD-L1、APE1蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

2.3 PD-L1、APE1蛋白與乳腺癌患者2年生存情況的關(guān)系

隨訪2年，PD-L1陽性組死亡8例，PD-L1陰性組死亡1例。PD-L1陽性組2年累積存活率[73.33%(22/30)]低于PD-L1陰性組[98.53%(67/68)](χ2=9.411，P=0.002)。APE1陽性組11例死亡，APE1陰性組1例死亡，APE1陽性組2年累積存活率[80.36%(45/56)]低于APE1陰性組[95.24%(40/42)](χ2=14.550，P=0.001)。見圖1、2。

圖1 PD-L1蛋白與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

乳腺癌癌組織病變主要好發(fā)于乳腺上皮組織，女性腫瘤疾病中，發(fā)生率占據(jù)16%左右，其死亡率占據(jù)7.8%左右[5]。乳腺癌疾病常被理解為“非炎性”腫瘤，基因突變發(fā)生率很低，但在乳腺癌癌組織內(nèi)具有大量浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞，有利于進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)治療[6]。PD-L1蛋白主要來源于T細(xì)胞、B細(xì)胞等，其與腫瘤細(xì)胞表面的受體PD-1相互作用，對(duì)T細(xì)胞活性、生長(zhǎng)等發(fā)揮抑制作用，進(jìn)一步發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的[7]。大量研究已證實(shí)[8]，PD-1/PD-L1信號(hào)通路活性可參與多種腫瘤疾病進(jìn)展過程，其發(fā)揮作用主要通過細(xì)胞免疫逃逸，可通過抑制此通路活性，增強(qiáng)T細(xì)胞活化程度及增殖等，進(jìn)一步提高機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，同時(shí)阻斷腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，最終抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。關(guān)于抗PD-1/PD-L1途徑的藥物已被用于多種腫瘤疾病，如非小細(xì)胞肺癌[9]、食管癌[10]、黑色素瘤[11]等，均取得理想療效。APE1蛋白具有雙重功能，不僅可以參與核苷酸切除修復(fù)過程，同時(shí)還可發(fā)揮氧化還原作用[12]。APE1蛋白在多種腫瘤疾病中均存在異常高表達(dá)的情況，并且其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布情況與多種因素有關(guān)，如腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)程度、細(xì)胞轉(zhuǎn)移等。也有研究顯示[13]，PD-L1及APE1異常表達(dá)與與乳腺癌患者預(yù)后有關(guān)。由此，本研究推測(cè)PD-L1及APE1可能作為乳腺癌疾病治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步對(duì)PD-L1及APE1深入研究對(duì)于乳腺癌疾病診療具有極其重要作用。

圖2 APE1蛋白與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

本次研究結(jié)果表明，與癌旁組織比較，癌組織PD-L1及APE1蛋白陽性表達(dá)率均明顯更高，提示PD-L1及APE1在乳腺癌疾病中擔(dān)當(dāng)促癌基因角色，進(jìn)而參與乳腺癌疾病進(jìn)展。進(jìn)一步探討PD-L1及APE1蛋白與乳腺癌病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及Ki-67表達(dá)有關(guān)，但與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)，分析其原因PD-L1與細(xì)胞表面PD-1相互作用，增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性，同時(shí)可參與細(xì)胞增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，進(jìn)而促進(jìn)疾病進(jìn)展。另外本研究發(fā)現(xiàn)APE1陽性表達(dá)主要與組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，表明APE1與乳腺癌疾病分化程度存在關(guān)系。但也有研究發(fā)現(xiàn)[14]，APE1與組織學(xué)分級(jí)無關(guān)，主要與雌激素受體、分子分型等有關(guān)。分析其原因可能與樣本量、實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)有關(guān)，APE1與乳腺癌臨床病理參數(shù)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PD-L1、APE1蛋白均在乳腺癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后有關(guān)，通過監(jiān)測(cè)其蛋白表達(dá)水平，可預(yù)測(cè)患者預(yù)后，同時(shí)本次研究也為進(jìn)一步了解乳腺癌疾病發(fā)病機(jī)制提供參考，具有一定研究?jī)r(jià)值。但是本研究也存在不足，關(guān)于PD-L1、APE1蛋白在乳腺癌相關(guān)關(guān)系及預(yù)后影響危險(xiǎn)因素有待進(jìn)一步研究。