基于全轉(zhuǎn)錄組測序分析多形性膠質(zhì)母細胞瘤增殖及侵襲的相關機制

王仕超，劉 斌，趙 星，任曉敏，潘園園，李 霞，徐淑英

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市第一醫(yī)院醫(yī)學遺傳實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的一類惡性腫瘤，其預后較差[1]。隨著對神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關機制研究的逐步深入，有學者通過靶向阻斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、侵襲或遷移的關鍵信號通路，達到了治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的目的[2-3]，這是一種理論上可行，且具有廣闊應用前景的新型治療方法[4]。在細胞特定狀態(tài)下進行全轉(zhuǎn)錄組的研究，可以從轉(zhuǎn)錄層面系統(tǒng)地揭示生物學背后的調(diào)控規(guī)律。目前，學者們對非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）的研究主要集中在微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）上。多項研究證實，高頻突變轉(zhuǎn)錄本在細胞周期、能量代謝和信號傳導等方面發(fā)揮重要作用，或可作為潛在的生物標志物應用于臨床腫瘤的靶向治療[5-6]。近年來，Hh（Hedgehog）通路異常激活與各種惡性腫瘤之間的關系越來越受到重視[7]。BOC蛋白作為Hh通路上游的跨膜蛋白，能夠通過增加局部Hh配體濃度或延長與Hh配體結(jié)合時間來放大Hh信號[8]，提示BOC蛋白可以影響整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Hh通路反應。本研究擬在轉(zhuǎn)錄組水平揭示GBM增殖、侵襲的發(fā)生、發(fā)展機制，探尋具體有哪些關鍵基因參與了GBM的進展，在此基礎上構(gòu)建circRNA-miRNA -mRNA、lncRNA-miRNA-mRNA的關聯(lián)分析，進一步驗證BOC蛋白對GBM的生物學作用機制，為臨床制定診療方案提供更可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年11月—2019年2月呼和浩特市第一醫(yī)院GBM患者4例，其中男2例、女2例，年齡43～65歲；另選取2019年12月呼和浩特市第一醫(yī)院65歲男性GBM患者1例。所有患者均依據(jù)《中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南（2015）》[9]確診，病理學分期為Ⅳ級。本研究經(jīng)呼和浩特市第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 樣本收集及處理

收集手術中切除的癌組織和癌旁組織（距癌組織邊緣1 cm）。以0.5 cm為標準直徑對癌組織樣本及癌旁組織樣本進行塊狀切割，用0.9%Nacl溶液沖洗后，用滅菌凍存管封存，并做好標記，立即儲存于液氮罐內(nèi)。

1.3 文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

樣本測序工作由天津諾禾致源基因測序公司完成，其中miRNA和lncRNA均獨立建庫，circRNA采用lncRNA建庫，去除樣本中的核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）后，對線性RNA和circRNA進行測序。將2018年11月—2019年2月收集的4例GBM患者分別作為A組、B組、C組、D組。4例患者的癌組織樣本分別編號為AT、BT、CT、DT；對應的癌旁組織編號為AC、BC、CC、DC。4組混測的癌組織編號為Q1，癌旁組織編號為Q2。4組混測方法與單樣本測序方法一致。

1.4 主要測序流程及內(nèi)容（以miRNA為例）

主要分析內(nèi)容包括樣本總RNA檢測、分類注釋、已知miRNA分析、ncRNA分析、重復序列比對、新miRNA預測、小分子RNA（small RNA，sRNA）分類注釋統(tǒng)計、miRNA分析、miRNA堿基編輯分析、miRNA家族分析、miRNA表達及差異分析、miRNA靶基因預測、差異miRNA靶基因富集分析、差異lncRNA表達共定位、基因本體（Gene Ontology，GO）富集（包括分子功能、生物學過程和細胞組分）及京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.5 組織樣本中BOC mRNA的檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測5例GBM患者組織樣本中BOCmRNA的相對表達量。PCR試劑盒購自上海英拜生物有限公司，檢測儀器為QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。引物由上海吉凱生物有限公司合成。引物序列見表1。反應體系：2×Master Mix 5.0 μL，PCR引物（10 μmol/L）各0.3 μL，加ddH2O至總體積為9 μL。反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃60 s，45個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算BOCmRNA的相對表達量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 mRNA的差異分析

高通量測序分析共篩選出3 088個癌組織與癌旁組織差異表達的mRNA，其中表達上調(diào)1 375個，表達下調(diào)1 713個，見圖1（a）。表達上調(diào)居前10位的基因分別為CUL2、HDGF、BOC、PTCH1、ACY1、BCL2L13、CRYAB、WNT5B、PIK3R3、ZNF658。表達下調(diào)居前10位的基因分別為PKA、Slmb、CK1、MMP8、LSM4、NFATC1、ZNF211、WDR7、MMP13、SHTN1。

4組間共有差異基因33個，分別為HIVEP2、NUB1、OLIG1、BOC、SOX8、LLGL1、PTK2B、SEMA6D、PRUNE2、SPOP、IL11RA、MAP4K4、SPOCK3、GPRASP1、POGZ、HIP1R、CALM3、ANK2、DIO2、OLIG2、DCX、F5、CLU、FLNB、KCNIP4、AK5、ZEB2、POU2F1、KCNJ10、RABGAP1L、BMPR1B、VIPR2、RHOT1。A組中癌組織與癌旁組織差異基因1 669個，其中表達上調(diào)768個、表達下調(diào)901個；B組差異基因3 571個，其中表達上調(diào)1 717個、表達下調(diào)1 854個；C組差異基因4 354個，其中表達上調(diào)1 715個、表達下調(diào)2 639個；D組差異基因5 708個，其中表達上調(diào)2 750個、表達下調(diào)2 958個。見圖1（b）。

對差異表達的mRNA進行KEGG通路富集分析，選擇富集最顯著的20條通路信息，涉及的KEGG通路包括癌信號途徑、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、cAMP信號通路、軸突導向及鈣信號途徑等通路。見圖1（c）。這些通路與免疫反應、氨基酸代謝、細胞增殖、蛋白轉(zhuǎn)運等生理生化反應有關。

對3 088個差異表達基因進行GO富集分析。結(jié)果顯示，有2 206個基因涉及生物學過程，其中1 082個表達上調(diào)、1 124個表達下調(diào)；有2 311個基因涉及細胞組分，其中901個表達上調(diào)、1 410個表達下調(diào)；有2 222個基因涉及分子功能，其中866個表達上調(diào)、1 356個表達下調(diào)。見圖1（d）。

圖1 mRNA測序分析結(jié)果

2.2 lncRNA的差異分析

測序結(jié)果顯示，差異表達的lncRNA共有106個，其中表達上調(diào)52個，包括lnc_000266、lnc_000276、lnc_000417、lnc_000510、lnc_000565、lnc_000662、lnc_000853、lnc_001155、lnc_001315、lnc_001370、lnc_001788、lnc_001827等；表達下調(diào)54個，包括ENST00000572151、lnc_000009、lnc_000021、lnc_000036、lnc_000115、lnc_000410、lnc_000467等。見圖2（a）。

4組間共有的差異lncRNA數(shù)目為0，見圖2（b）。A組和B組篩選出的癌組織與癌旁組織差異表達的lncRNA均為151個，C組和D組分別篩選出221和290個。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，差異lncRNA共表達mRNA主要涉及的細胞通路有血小板活化及基礎轉(zhuǎn)錄因子、環(huán)磷酸鳥苷蛋白激酶信號以及神經(jīng)活性配體-受體互作等相關途徑。見圖2（c）。

對1 098個差異表達的lncRNA靶基因進行GO富集分析，其中685個基因表達上調(diào)、413個基因表達下調(diào)，見圖2（d）。

圖2 lncRNA測序分析結(jié)果

2.3 circRNA的差異分析

測序得到差異表達的circRNA共82個，其中表達上調(diào)32個，包括hsa_circ_0047720、hsa_circ_0050334、hsa_circ_0067774、hsa_circ_0068375、hsa_circ_0069397、hsa_circ_0069982、hsa_circ_0078241等；表達下調(diào)50個，包括hsa_circ_0004027、hsa_circ_0004101、hsa_circ_0004550、hsa_circ_0006323、hsa_circ_0006528、hsa_circ_0010459、hsa_circ_0010466、hsa_circ_0017673、hsa_circ_0027641等。見圖3（a）。

4組間共有的差異circRNA為245個，其中已知的circRNA 156個，包括hsa_circ_0000814、hsa_circ_0000894、hsa_circ_0000970、hsa_circ_0001277、hsa_circ_0001289、hsa_circ_0001475等；新定義circRNA 89個，包括novel_circ_0000585、novel_circ_0000886、novel_circ_0001046、novel_circ_0002180、novel_circ_0002215、novel_circ_0002371等。見圖3（b）。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，差異表達的circRNA涉及的細胞通路有新陳代謝、MAPK信號通路、細胞內(nèi)嗜作用等相關途徑。共有的差異circRNA的GO富集分類統(tǒng)計圖見圖3（d），細胞組分分析以胞液與細胞間組分最為顯著。

圖3 circRNA測序分析結(jié)果

2.4 miRNA的差異分析

差異表達的miRNA共15個，其中表達上調(diào)8個，分別為hsa-miR-3157-3p、hsa-miR-6761-5p、hsa-miR-3124-5p、hsa-miR-5009-5p、hsamiR-216b-3p、hsa-miR-296-3p、novel_912、novel_328；表達下調(diào)7個，分別為hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-153-5p、hsa-miR-299-3p、hsamiR-4473。見圖4（a）。

繪制多組比較的差異miRNA韋恩圖，選擇2個組、3個組或4個組比較得到的差異miRNA數(shù)進行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，4組間交集的miRNA數(shù)為0。見圖4（b）。

差異表達miRNA的KEGG富集通路散點圖見圖4（c）。

圖4 miRNA測序分析結(jié)果

4組癌組織樣本（AT、BT、CT、DT）之間的r2值接近0.95，癌旁組織（AC、BC、CC、DC）之間的r2值接近0.93，表明不同樣本之間表達模式的相似度較高。見表1。

表1 4組不同樣本之間的相關性

2.5 mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA的關聯(lián)分析

在競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）理論的基礎上，根據(jù)結(jié)合點位是否相同來尋找與miRNA同類的lncRNA與基因的配對等，完成ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建。見圖5、圖6。

圖5 mRNA-miRNA-circRNA的關聯(lián)分析

圖6 mRNA-miRNA-lncRNA的關聯(lián)分析

利用miRBase數(shù)據(jù)庫構(gòu)建33個差異表達基因的miRNA-lncRNA-mRNA 的關聯(lián)分析，見圖7。其中BOC基因位于調(diào)控網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點，以BOC為核心進行拓撲分析，結(jié)果顯示，BOC與has-miR-4763-5p、has-miR-6848-5p、has-miR-6860 miRNA具有潛在的靶向結(jié)合位點，這3類miRNA下游存在POU2F1、TP53等與腫瘤發(fā)生相關的基因轉(zhuǎn)錄本，見圖8。

圖7 mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA的關聯(lián)分析

圖8 BOC與ncRNA、基因的關聯(lián)分析

采用STRING數(shù)據(jù)庫中的Confidence Score可靠指數(shù)對每個預測的相互關聯(lián)性進行分析。結(jié)果顯示，SHH、CDON、PTCH1等蛋白與BOC關聯(lián)，主要定位在Hh通路上。見圖9。

圖9 BOC-蛋白互作分析圖

2.6 癌組織與癌旁組織中BOC mRNA相對表達量的比較

5例GBM患者中有4例患者癌組織BOCmRNA水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05），1例患者癌組織BOCmRNA水平低于癌旁組織（P＜0.05）。見圖10。

圖10 5例GBM患者癌組織與癌旁組織BOC mRNA相對表達量比較

3 討論

ncRNA在各種生物過程中起著重要的調(diào)控作用。本研究基于全轉(zhuǎn)錄組測序，同時分析5例GBM患者癌組織與癌旁組織中差異表達的mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA，并且通過兩兩關聯(lián)分析、三元關聯(lián)分析、多元關聯(lián)分析，深入挖掘相關轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。

本研究篩選出的差異表達的mRNA中已有多個被證實與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，如Rab23[10]、RAS[11]、BRAF[12]、VEGF[13]、PTCH1[14]、MAPK[15-16]等基因。有研究結(jié)果顯示，Rab23 mRNA及蛋白在膠質(zhì)瘤組織中高表達，其表達水平與病理分級相關[10-11]。本研究結(jié)果顯示，癌組織RAS家族中與增殖相關的蛋白（ERAS、GEM、HRAS、KRAS、MRAS）的mRNA相對表達量顯著高于癌旁組織，與文獻報道[13]一致。

BRAF基因編碼的蛋白屬于raf/mil家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)控MAPK/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路，通過細胞分裂、分化、分泌等功能促進腫瘤形成[12]。MAPK是在真核生物中非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與了細胞增殖、分化、運動及凋亡等生物過程。本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤患者癌組織BRAFmRNA、MAPKmRNA呈高表達，提示BRAF、MAPK等癌基因參與了GBM的惡性增殖、侵襲等生物學過程。

本研究篩選得到的差異表達mRNA的轉(zhuǎn)錄本富集通路包括Shh（Sonic hedgehog）信號途徑、膠質(zhì)瘤信號途徑、胰腺癌信號途徑、軸突導向、TNF信號途徑等通路，這些通路與免疫反應、氨基酸代謝、細胞增殖、蛋白轉(zhuǎn)運等生理生化反應相關。BOC作為跨膜蛋白定位在Shh信號途徑上游。本研究結(jié)果顯示，癌組織BOCmRNA水平高于癌旁組織（P＜0.05），與文獻報道[17]一致。SHERGALIS等[17]利用TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織BOC高于正常腦組織（P＜0.05），高表達BOC的膠質(zhì)瘤患者生存期明顯縮短。提示BOC激活了Hh信號途徑，可促進GBM的進展，因此BOC有成為藥物靶點的潛力。

GBM的發(fā)生、發(fā)展與mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA之間復雜的調(diào)控關系密切相關。本研究構(gòu)建GBM mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA調(diào)控網(wǎng)絡后分析了網(wǎng)絡拓撲特性，發(fā)現(xiàn)BOC、miR-4763-5P、miR-6848-5P、miR-6880是關鍵節(jié)點。進一步對這些關鍵節(jié)點及其相互作用的RNA進行功能富集分析和生存分析，結(jié)果顯示，與miR-6880具有潛在結(jié)合位點的lncDUBR、lnc003875已被證實與多種腫瘤發(fā)生相關[18]，提示BOC可能通過與miRNA結(jié)合，調(diào)控下游基因來影響腫瘤的進展。lnc003875/miR-363/EGR1在癌相關成纖維細胞調(diào)控網(wǎng)絡中的作用是控制人胎盤部位滋養(yǎng)層腫瘤的血管生成。另外，lnc003745、lnc003874、lnc001254、lnc001763、lnc002545、lnc002436、lnc003671、lnc3371、lnc00798、DCTN1-AS1、RP11-1055B83、lnc00653、c20orf166-AS1共計13個lncRNA也出現(xiàn)在BOC相關的互作網(wǎng)絡中，其中C20orf166-AS1與抗原處理、表達和細胞黏附分子通路相關。目前，C20orf166-AS1已被證實與MAPK信號通路相關，可導致前列腺癌、胃癌的發(fā)生[19]。lnc001763、lnc002436與病灶粘連、細胞外基質(zhì)受體相互作用、MAPK信號通路相關，共涉及到12個基因。

關于circRNA在惡性腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲性生長和腫瘤血管新生等過程中的調(diào)控作用是目前腫瘤研究的熱點。本研究結(jié)果顯示，circRNA0000543、circRNA0003666、circRNA0047270、circRNA0010465等8個circRNA參與了BOC的互相作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，circSMARCA5和circCFH與膠質(zhì)瘤的特異性表達模式有關，這些circRNA或可作為腫瘤的生物標志物[20]。此外，一些circRNA已被發(fā)現(xiàn)在GBM中發(fā)揮致癌作用，如circNFIX、circNT5E；而另一些circRNA則具有抑癌作用，如circFBXW7、circSHPRH[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)了多個差異表達且尚未報道的circRNA，其對GBM的調(diào)控機制還有待進一步驗證。

本研究全轉(zhuǎn)錄組多元關聯(lián)分析結(jié)果顯示，BOC位于調(diào)控網(wǎng)絡關鍵節(jié)點位置，其定位的Hh信號途徑在被異常激活的情況下會促進多種惡性腫瘤的進展，提示BOC可能受相關miRNA、circRNA、lncRNA的調(diào)控，影響下游靶基因的表達，參與了腫瘤增殖與侵襲的過程。本研究還對5例GBM患者癌組織和癌旁組織中BOCmRNA的相對表達量進行了檢測，結(jié)果顯示，有4例患者癌組織BOCmRNA水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05），1例患者癌組織BOCmRNA水平低于癌旁組織（P＜0.05）。后續(xù)研究將重點針對BOC是否在GBM的致病機制中發(fā)揮癌基因作用，進一步在細胞層面進行驗證。

綜上所述，本研究利用二代測序技術對4例GBM患者的腫瘤組織及癌旁組織進行全轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選后得到33個共有差異基因，深入分析后挖掘到1個可能與GBM增殖、侵襲、遷移密切相關且定位于Hh通路的關鍵基因BOC。進一步對mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA多元關聯(lián)網(wǎng)絡拓撲分析發(fā)現(xiàn)，BOC位于調(diào)控網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點位置，且其定位的Hh信號途徑在異常激活的情況下會促進多種腫瘤的惡性進程，提示BOC受到相關miRNA、circRNA、lncRNA的調(diào)控，影響下游靶基因的表達，從而導致GBM的發(fā)生。