蒽醌類光敏劑的合成及光活性構(gòu)效關(guān)系計算

童浩文, 高磊, 王立升, 劉旭*

(1.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 廣西 南寧 530004;2.廣西大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 廣西 南寧 530004)

0 引言

光動力療法(photodynamic therapy, PDT)是最有發(fā)展前景的腫瘤治療手段之一,具有微創(chuàng)性和低暗毒性等特點,可用于非腫瘤性疾病以及各種類型癌癥的治療[1]。光動力學(xué)的核心成分包括光敏劑、氧氣以及特定波長的光。在有氧條件下,光敏劑暴露于特定波長的光時,光的部分能量隨光子吸收后的熱衰變或熒光輻射而釋放出來,剩余的能量也可以轉(zhuǎn)化為磷光或活性氧類,活性氧已被證明具有導(dǎo)致細胞凋亡和壞死的能力[2-4]。目前為止,雖然光動力療法取得了部分成果；但調(diào)控光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力仍是待解決的關(guān)鍵問題之一[5]，因此,開發(fā)能夠被特定癌細胞環(huán)境激活且同時規(guī)避對正常細胞的毒副作用的光敏劑(激活條件如酸性環(huán)境或特定的酶)十分有必要[6-9]。

大黃酚是一種來源于中草藥大黃的天然蒽醌類色素，廣泛分布于我國各地[10]。這些色素除了具有多種生物活性和價格低廉的特點外，還具有極敏感的光敏性，被稱為光敏劑[11]；但因為其具有毒副作用強、選擇性差等性質(zhì)，所以不能有效區(qū)分正常組織和癌變部位，靶向能力差，限制了其在臨床實踐上的應(yīng)用[12]。

為了解決上述問題，本文設(shè)計一系列新型可激活光敏劑(activated-photosensiter, APs)，其中化合物A3在一系列表征與分析中性能較為突出，為蒽醌類光敏劑的研究提供了參考，具備一定為光動力法治療癌癥的潛在價值。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

真空干燥箱(DZF-6020型，上海目尼實驗設(shè)備有限公司)；集熱式恒溫磁力攪拌加熱器(DF-101SA型，上海瑪尼儀器設(shè)備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-1001N型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；手提紫外分析儀(ZF-5型，上海嘉鵬儀器有限公司)；磁力攪拌器(IKAMAGMS4型，上?，斈醿x器設(shè)備有限公司)；電子天平(JA11002B型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；托盤天平(JA51001B型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；真空泵(2FY-4C-N型，鄭州科工貿(mào)有限公司)；雙光束紫外可見分光光度計(UV-2100型，北京瑞利分析儀器有限公司)；熒光分光光度計(96PRO型，上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；雷磁精密酸度計(PHSJ-4A型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；氙燈(CEL-TCX250型，北京中教金源科技有限公司)；超聲波清洗機(PS-100A型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLCI-CLASS-XEVOVG2-XSQTOF型，美國WATERS公司)；核磁共振儀(Bruker600MH型，德國Bruker公司)。

1.2 實驗材料

大黃酚(CP, 上海源葉生物科技有限公司)；對甲苯磺酰氯(AR, 上海麥克林生化科技有限公司)；無水丙酮(AR, 廣東光華科技股份有限公司)；碳酸鉀(AR, 天津大茂化學(xué)試劑廠)；N,N-二乙基乙二胺(AR, 上海麥克林生化科技有限公司)；乙二醇甲醚(AR, 廣東光華科技股份有限公司)；N-(2-氨基乙基)嗎啉(AR, 上海麥克林生化科技有限公司)；4-嗎啉甲基苯胺(AR, 上海麥克林生化科技有限公司)；3-二甲胺基丙胺(AR, 上海麥克林生化科技有限公司)；三乙胺(AR, 廣東光華科技股份有限公司)；三氯甲烷(AR, 成都市科龍化工試劑廠)；N, N-二甲基甲酰胺(AR, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；正己烷(AR, 廣東光華科技股份有限公司)；氘代氯仿(AR, 薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司)；二氯甲烷(AR, 廣東汕頭市西隴化工廠)；乙酸乙酯(AR, 廣東汕頭市西隴化工廠)；石油醚(AR, 廣東汕頭市西隴化工廠)；甲醇(AR, 廣東汕頭市西隴化工廠)；乙醇(AR, 廣東汕頭市西隴化工廠)；二氫卟吩e6(AR, 上海源葉生物科技有限公司)；ABDA單線態(tài)氧指示劑(AR, 上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模

定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship, QSAR)是指通過數(shù)學(xué)方法建立化合物分子描述符與其生物活性、毒性之間的線性或非線性關(guān)系模型,在分子水平上闡明化合物的分子結(jié)構(gòu)與生物理化性質(zhì)之間的關(guān)系[13]，是一種新型藥物模型,為設(shè)計結(jié)構(gòu)、活性檢測和毒性預(yù)測奠定基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的體外實驗、體內(nèi)動物實驗以及傳統(tǒng)藥物活性篩選所需的有限的人體觀察相比,QSAR可以大大縮短實驗時間、節(jié)省人力、降低實驗成本[14]。SYBYL軟件可用于先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)修飾及改造,在化合物的三維結(jié)構(gòu)信息缺失的情況下,也能建立高預(yù)測能力的QSAR模型。

本文蒽醌光敏劑合成路線[15-16]如圖1所示。

圖1 蒽醌光敏劑合成路線

首先通過查找文獻,找出具有蒽醌結(jié)構(gòu)式骨架的化合物,并查找得到相應(yīng)的蒽醌類化合物的半數(shù)最大效應(yīng)濃度(EC50)數(shù)值[17],之后計算出它們的-ln(EC50)數(shù)值,以此數(shù)值作為化合物的毒理學(xué)指標(biāo),如表1所示。在文獻中找到的化合物,首先利用Chemdraw軟件畫出其結(jié)構(gòu)式,并將文件改成.mol格式,之后將文件導(dǎo)入SYBYL軟件中建立數(shù)據(jù)庫,同時輸入-ln(EC50)數(shù)據(jù),以活性最高的化合物作為模板分子,采用Align Database的方法對數(shù)據(jù)庫中化合物分子進行疊合,疊合完畢后,對數(shù)據(jù)庫表格進行刷新。添加CoMFA列,通過抽一法(leave-one-out)對數(shù)據(jù)庫進行交叉驗證得到交叉驗證系數(shù)Q2等于0.545,最佳主成分數(shù)為5,說明模型的預(yù)測能力較好。再進行回歸分析得到?jīng)Q定系數(shù)R2為0.908,說明模型的擬合能力較好。所建立的模型的Q2大于0.5,R2接近于1,說明所建模型具有良好的可信度。

表1 蒽醌類化合物的光活性數(shù)據(jù)

1.3.2 產(chǎn)物A1、A2的合成

稱取大黃酚(0.472 4 g,1.858 1 mmol)、碳酸鉀(1.283 9 g)、對甲苯磺酰氯(1.774 1 g,9.290 5 mmol)于雙頸燒瓶中(100 mL),氮氣保護下,加入4 mL無水丙酮,加熱至回流,反應(yīng)18 h后,進行冷卻。對初步產(chǎn)物進行旋干,加入二氯甲烷(50 mL),過濾除去固體物質(zhì)雜質(zhì),再利用柱色譜法進行分離提純[流動相:V(DCM)∶V(PE)=1∶7],得到黃色的固體產(chǎn)物A(0.896 7 g,1.594 mmol,收率86%)。稱取產(chǎn)物A(200 mg,0.355 5 mmol)于雙頸燒瓶中(100 mL),氮氣保護下,加入乙二醇甲醚(8 mL),升溫攪拌至回流,加入N-(2-氨基乙基)嗎啉(0.24 mL,1.777 0 mmol),反應(yīng)4 h后,冷卻,旋干,經(jīng)硅膠柱分離提純[流動相:V(DCM)∶V(MeOH)=100∶1],得到紅色固體產(chǎn)物A1(35.17 mg,0.096 0 mmol, 收率27%)、深紅色固體產(chǎn)物A2(56.08 mg, 0.117 3 mmol, 收率33%)。

1.3.3 產(chǎn)物A3、A4、A5的合成

稱取產(chǎn)物A(215 mg, 0.382 9 mmol)加入雙頸燒瓶中(50 mL),氮氣保護下,加入乙二醇甲醚(8 mL),升溫攪拌至回流,加入N, N-二乙基乙二胺(0.28 mL),反應(yīng)5 h后,冷卻,旋干,經(jīng)硅膠柱分離提純[流動相:V(DCM)∶V(MeOH)=50∶1],得到紫色固體產(chǎn)物A3(77.64 mg,0.172 3 mmol,收率45%)、紅色固體產(chǎn)物A4(44.62 mg,0.088 0 mmol, 收率23%)和紅色固體產(chǎn)物A5(28.33 mg,0.080 4 mmol,收率21%)。

蒽醌衍生物A1，A2，…，A5的結(jié)構(gòu)式和分子式見表2。

表2 蒽醌衍生物的結(jié)構(gòu)式和分子式

1.4 目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)及譜圖數(shù)據(jù)

A1: 1-羥基-3-甲基-8-(2-嗎啉乙基)氨基)蒽-9,10-二酮，紅色固體,收率27%,熔點(mp)為112～114 ℃。核磁共振氫譜:1H-NMR(500 MHz, CDCl3,m=多重峰,t=三重峰,d=雙重峰,s=單重峰)，δ:13.16(s, 1H), 9.64(t,J=4.7 Hz, 1H), 7.75(dd,J=7.6, 1.2 Hz, 1H), 7.60～7.53(m, 1H), 7.43(d,J=1.5 Hz, 1H), 7.24(dd,J=8.3, 1.2 Hz, 1H), 6.83(s, 1H), 3.79(t,J=4.6 Hz, 4H), 3.44(q,J=5.9 Hz, 2H), 2.76(t,J=6.3 Hz, 2H), 2.58(q,J=4.8, 3.7 Hz, 4H), 2.42(s, 3H)。核磁共振碳譜:13C-NMR(126 MHz, CDCl3,s=單重峰),δ：189.65(s), 183.46(s), 162.04(s), 151.89(s), 147.17(s), 135.01(s), 134.46(s), 133.31(s), 124.19(s), 118.76(s), 117.96(s), 117.89(s), 117.30(s), 110.74(s), 67.07(s), 56.56(s), 53.40(s), 39.85(s), 29.71(s), 22.49(s), 14.13(s)。HRMS(ESI):理論計算值:([C21H22N4O2+H]+)m/z =367.165 23,實測值:m/z = 367.162 66。

A2: 3-甲基-1,8-二(2-嗎啉乙基)氨基)蒽-9,10-二酮，深紅色固體,收率33%, 熔點(mp)為132～133 ℃。核磁共振氫譜:1H-NMR(500 MHz, CDCl3,m=多重峰,t=三重峰,d=雙重峰,s=單重峰)，δ：9.76(d,J=20.6 Hz, 1H), 7.55(dd,J=7.4, 1.1 Hz, 1H), 7.48(t,J=7.9 Hz, 1H), 7.39(d,J=1.4 Hz, 1H), 7.01(dd,J=8.6, 1.1 Hz, 1H), 6.82(s, 1H), 3.80(t,J=4.6 Hz, 8H), 3.45(td,J=6.5, 4.7 Hz, 4H), 2.78(td,J=6.6, 1.9 Hz, 4H), 2.61(dt,J=7.5, 2.5 Hz, 8H), 2.41(s, 3H)。核磁共振碳譜:13C-NMR(126 MHz, CDCl3,s=單重峰),δ:188.52(s), 184.88(s), 151.15(s), 150.80(s), 145.07(s), 134.41(s), 134.17(s), 133.97(s), 117.61(s), 117.58(s), 116.46(s), 114.97(s), 114.78(s), 112.75(s), 67.00(s), 57.07(s), 57.05(s), 53.56(s), 40.07(s), 40.06(s), 29.70(s), 22.25(s)。HRMS(ESI):理論計算值:([C27H34N4O4+H]+)m/z =479.265 28,實測值:m/z =479.262 05。

A3: 1,8-二(2-(二乙氨基)乙基)氨基)-3-甲基蒽-9,10-二酮，紫色固體,收率45%,熔點(mp)為135～136 ℃。核磁共振氫譜:1H-NMR(500 MHz, CDCl3, m=多重峰,t=三重峰,d=雙重峰,s=單重峰)，δ:9.67(dt,J=21.9, 5.1 Hz, 2H),7.52(dd,J=7.4, 1.2 Hz, 1H),7.52(dd,J=7.4, 1.2 Hz, 1H),7.48～7.43(m, 1H),7.36(d,J=1.5 Hz, 1H),7.02(dd,J=8.5, 1.2 Hz, 1H),6.87～6.80(m, 1H),3.49(q,J=6.3 Hz, 4H),3.08～2.62(m, 12H),2.38(s, 3H),1.17(td,J=7.2, 3.8 Hz, 12H)。核磁共振碳譜:13C-NMR(126 MHz, CDCl3, s=單重峰)，δ:188.38(s), 185.06(s), 151.27(s), 150.94(s), 144.85(s), 134.41(s), 134.17(s), 133.82(s), 117.64(s), 117.62(s), 116.20(s), 114.71(s), 114.67(s), 112.66(s), 51.71(s), 51.67(s), 47.24(s), 41.39(s), 41.38(s), 22.23(s), 11.90(s).HRMS(ESI):理論計算值:([C27H38N4O2+H]+)m/z=451.306 75,實測值:m/z =451.303 92。

A4: 8-(2-二乙氨基乙基)氨基-3-甲基-9,10-二氧-9,10-二氫蒽-1-基-4-甲基苯磺酸鹽，紅色固體,收率23%,熔點(mp)為117～118 ℃。核磁共振氫譜:1H-NMR(500 MHz, CDCl3, m=多重峰,t=三重峰,d=雙重峰,s=單重峰)，δ:9.57(t,J=5.4 Hz, 1H),8.01(s, 1H),7.79(d,J=8.8 Hz, 2H),7.48(d,J=5.3 Hz, 2H),7.31-7.18(m, 3H),7.10～6.97(m, 1H),3.39(q,J= 6.4 Hz, 2H),2.81(t,J=6.9 Hz, 2H),2.67(q,J=7.2 Hz, 4H),2.40(d,J=40.8 Hz, 6H),1.13(t,J=7.1 Hz, 6H)。核磁共振碳譜:13C NMR(126 MHz, CDCl3, s=單重峰)，δ:183.29(s), 183.01(s), 151.17(s), 147.72(s), 145.27(s), 144.63(s), 134.74(s), 134.73(s), 133.68(s), 132.74(s), 130.58(s), 129.48(s), 129.40(s), 128.87(s), 128.83(s), 126.56(s), 125.32(s), 118.18(s), 114.94(s), 113.65(s), 51.64(s), 47.29(s), 41.40(s), 29.70(s), 21.67(s), 21.57(s), 11.87(s)。HRMS(ESI):理論計算值:([C28H30N2O5S+H]+)m/z =507.194 82,實測值:m/z =507.191 41。

A5: 8-((2-(二乙氨基)乙基)氨基)-1-羥基-3-甲基蒽-9,10-二酮，紅色固體,收率21%,熔點(mp)為117～118 ℃。核磁共振氫譜:1H-NMR(500 MHz, CDCl3, m=多重峰,t=三重峰,d=雙重峰,s=單重峰)，δ：3.41(q,J=5.9 Hz, 2H),2.81(t,J=6.4 Hz, 2H),2.65(q,J=7.1 Hz, 4H),2.41(s, 3H),1.11(t,J=7.1 Hz, 6H)。核磁共振碳譜:13C NMR(126 MHz, CDCl3, s=單重峰)，δ：189.50(s), 183.54(s), 162.01(s), 152.03(s), 147.07(s), 134.90(s), 134.44(s), 133.34(s), 124.12(s), 118.69(s), 118.00(s), 117.86(s), 117.35(s), 110.60(s), 51.30(s), 47.08(s), 29.71(s), 22.48(s), 14.13(s), 11.89(s)。HRMS(ESI):理論計算值:([C21H24N2O3+H]+)m/z =353.185 97,實測值:m/z =353.185 97。

1.5 紫外-可見光光譜

制備化合物濃度為10 μmol/L溶液[V(H2O)∶V(MeOH)=1∶1, 50 mL]。借助濃度為 5 mol/L的鹽酸和5 mol/L的氫氧化鈉溶液,將樣品溶液pH由酸性調(diào)為堿性,即pH值分別為2.0～8.0的7組待測溶液,加入酸或堿的量應(yīng)盡可能少,以避免稀釋。記錄波長范圍為400～800 nm的波長吸收曲線,獲得最大吸收的波長數(shù)據(jù)和吸光度。所有實驗均在室溫下使用石英比色皿進行。

1.6 熒光光譜

制備樣品濃度為10 μmol/L溶液[V(H2O)∶V(MeOH)=1∶1, 50 mL]。利用濃度為 5 mol/L 的鹽酸和5 mol/L的氫氧化鈉溶液,將樣品溶液pH由酸性調(diào)為堿性,pH分別為2.0～8.0的7組待測溶液,加入酸或堿的量應(yīng)盡可能少,以避免稀釋。利用熒光光度計對化合物的激發(fā)波長進行測定,確定激發(fā)波長后,從而測量不同pH值下化合物的熒光發(fā)射波長強度,所有實驗均在室溫下使用石英比色皿進行。

1.7 單線態(tài)氧檢測

以9,10-蒽二基-二(亞甲基)二丙二酸(ABDA)作為單線態(tài)氧指示劑,以光敏劑二氫卟吩e6(Ce6)作為標(biāo)準(zhǔn)對照組。將1 mg ABDA溶于1 mL甲醇中配制質(zhì)量濃度為1 g/L的ABDA指示劑溶液,避光冷藏備用。用移液槍量取2份123 μL的ABDA指示劑溶液(質(zhì)量濃度為1 g/L),分別加入到2份樣品濃度為10 μmol/L 的4 mL溶液中[V(MeOH)∶V(H2O)=1∶1],pH分別為5.5和7.4。以氙燈為光源,功率為250 W,對樣品進行照射,每隔1 min,取樣測一次紫外吸收波長,收集波長范圍為300～650 nm的紫外吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 模型分析

不同角度下觀察的模型視圖如圖2所示,圖中黃色部分(虛線)表示親水性基團,藍色部分(實線)表示疏水性基團,減小黃色部分基團或增加藍色部分基團能增強化合物的活性。實驗中,我們對蒽醌母核上1號、8號碳位置進行了改造,分別引入疏水基團，所以,通過模型分析可以初步判斷所合成的化合物具有一定的光活性。

圖2 不同角度下觀察的模型視圖

2.2 合成產(chǎn)物的討論

最終化合物的合成分兩步反應(yīng),首先通過酯化反應(yīng)得到中間產(chǎn)物A,然后對產(chǎn)物A進行修飾,得到最終產(chǎn)物。

該反應(yīng)具有條件比較溫和、穩(wěn)定、效率高且適用范圍廣的特點,對所合成出來的化合物經(jīng)核磁共振氫譜、碳譜、質(zhì)譜進行表征,產(chǎn)物結(jié)構(gòu)得到了確證。

最終產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定,但在分離純化時因產(chǎn)物點相離較近而不易分離,在對產(chǎn)物進行柱色譜分離后的產(chǎn)物還需進行重結(jié)晶等純化步驟。由于使用了高沸點溶劑以及溶劑石油醚造成譜圖有溶劑峰,不易去除,需要對產(chǎn)物進行再次處理以便降低溶劑峰,因此導(dǎo)致終產(chǎn)率比較低。

2.3 光物理性質(zhì)

在化合物A3的合成過程中,引入可質(zhì)子化的叔胺基(N,N-二乙基乙二胺),使化合物吸收最大波長相比于大黃酚發(fā)生了顯著紅移(圖3),有利于光穿透組織激活光敏劑,吸收最大值的增加對 PDT 的應(yīng)用非常有益。由于胺基質(zhì)子化,化合物A3的吸收光譜在酸性 pH 值中顯示出輕微的藍移,證實了光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(photoinduced electron transfer,PET)機理的存在。如圖3(b)所示,以530 nm為激發(fā)波長,在653 nm處觀察到最大發(fā)射波長。

(a)紫外可見光譜

事實上,當(dāng) pH 從 8.4 變化到 2.3 時,熒光發(fā)射強度幾乎增加了近 8.4 倍,進一步證實了PET機制的存在。在低pH值下觀察到的化合物A3的熒光增強可歸因于叔胺基的質(zhì)子化,約束了 PET 過程,然后將熒光“打開”。在沒有質(zhì)子化的情況下,N原子的孤對電子可以轉(zhuǎn)移到激發(fā)的化合物A3上,然后熒光被猝滅。對所有測量的光譜進行分析可得結(jié)論化合物A1，A2，…，A5均具有PET的性質(zhì),熒光強度隨化合物的質(zhì)子化程度的增加而增強。

2.4 光化學(xué)性質(zhì)

目前單線態(tài)氧的檢測方法包括直接檢測法和間接檢測法,本文所采用的檢測方法為間接檢測法中的紫外吸收光譜法,其原理是通過監(jiān)測熒光探針與單線態(tài)氧反應(yīng)后紫外吸收光譜的變化,間接檢測單線態(tài)氧。本次測量實驗中,以Ce6作為對照,所采用的ABDA指示劑濃度為25 μmol/L。由圖4—6可知,加入ABDA指示劑測量化合物A3在不同pH環(huán)境中,隨著光照時間的增長,產(chǎn)生的活性氧越多,紫外吸收也隨之減小。而在pH=5.5的環(huán)境中,在5 min內(nèi)紫外吸光度下降了84%,比在pH=7.4環(huán)境中更為顯著,活性氧的產(chǎn)生能力明顯優(yōu)于對照組和其余光敏劑，且主吸收峰處的吸光度基本不發(fā)生變化,由此可見化合物A3具有較好的光穩(wěn)定性。

(a)pH=5.5

(a)pH=5.5

(a)pH=5.5

3 結(jié)論

本文借助SYBYL軟件對數(shù)據(jù)進行處理,構(gòu)建得到的蒽醌類化合物光活性QSAR模型,具有較好的擬合效果和內(nèi)部預(yù)測能力，因此新型蒽醌類先導(dǎo)化合物的研發(fā)可基于SYBYL軟件并依據(jù)關(guān)鍵活性位點進行設(shè)計?；谒⒌哪Ｐ?設(shè)計了一系列質(zhì)子活化的大黃酚衍生物。此外,通過化合物的合成、表征及光譜測定,對不同pH條件下的紫外吸收度和熒光強度進行了檢測,并使用ABDA單線態(tài)氧指示劑,通過測試紫外吸收強度的變化表征單線態(tài)氧的產(chǎn)生，并且合成的化合物具有較強熒光性,發(fā)射峰在600～700 nm,這一范圍屬于紅光范圍,有效避開了生物自發(fā)光范圍(400～500 nm)。單線態(tài)氧的檢測實驗中,在相同光照條件下,酸性環(huán)境中所產(chǎn)生的單線態(tài)氧數(shù)量比弱堿性環(huán)境中所產(chǎn)生的量更多,且產(chǎn)生單線態(tài)氧的量與模型所預(yù)測的結(jié)果一致。光動力療法可實現(xiàn)精準(zhǔn)治療以此保證在達到治療效果的同時減小對正常細胞組織的傷害,對蒽醌類衍生物的研究有望解決較多威脅人類健康的癌癥、腫瘤問題，并且蒽醌類化合物分布廣泛,材料易于獲取,因此具有巨大的開發(fā)前景。