Sirt1對小鼠肝再生影響的研究

魏 韜 周晶琳 徐紹娜 劉 洋 陸 迪 祝慧慧

（牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江，157011）

小鼠部分肝切除是一種簡單、有效且安全的肝損傷模型，術(shù)后肝功能的恢復(fù)主要取決于殘余肝臟的迅速再生能力。因此，研究肝再生的分子機制具有重要的臨床意義。

組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶Sirt1是Sirtuins家族成員之一，在哺乳動物細胞中普遍表達，主要定位于細胞核和細胞質(zhì)中。Sirt1通過對靶蛋白去乙?；饔脜⑴c機體的多種生物過程，如基因轉(zhuǎn)錄、氧化應(yīng)激、能量代謝、細胞衰老和免疫炎性反應(yīng)等。研究表明，Sirt1在肝癌組織和細胞系中高表達，提示其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。通過Sirt1對大鼠肝毒性藥物化學(xué)損傷肝臟的細胞保護及細胞毒性的調(diào)節(jié)作用的研究，表明Sirt1很可能是作為參與肝保護的因子。然而，Sirt1在肝再生過程中的作用還不清楚，亟需深入研究探討。因此，本研究以小鼠為研究對象，對Sirt1在肝再生中的作用進行初步調(diào)查研究，以期為臨床肝再生治療提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和藥品

①實驗儀器：LD4-2A型低速離心機（生產(chǎn)企業(yè)：北京醫(yī)用離心機廠） ，世安通風(fēng)柜（生產(chǎn)企業(yè)：北京世安科興科技開發(fā)有限公司），F(xiàn)A1104型電子天平（生產(chǎn)企業(yè)：上海良平儀器儀表有限公司） ，101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（生產(chǎn)企業(yè)：天津市泰斯特儀器有限公司） ，微量紫外分光光度計（生產(chǎn)企業(yè)：美國Thermo Fisher有限公司），EcoTMReal-Time PCR儀（生產(chǎn)企業(yè)：Illumina有限公司），高壓滅菌鍋（生產(chǎn)企業(yè)：上海博訊有限公司），肝素鈉抗凝管（生產(chǎn)企業(yè)：石家莊康衛(wèi)仕醫(yī)療器械有限公司），生物安全柜（生產(chǎn)企業(yè)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、狗兔二用解剖臺（生產(chǎn)企業(yè)：上?？禐獒t(yī)療科技發(fā)展有限公司），手術(shù)燈、鼠籠、小鼠固定用泡沫磚、大頭針、固定線、注射器、針頭、手術(shù)刀、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、眼科剪、蚊式止血鉗、眼科鑷、培養(yǎng)皿、縫針、非吸收性外科縫線、無菌紗布、無菌棉球、一次性使用滅菌橡膠外科手套。0.9%氯化鈉溶液、 醫(yī)用乙醇、碘伏、烏拉坦。

②實驗藥品：TRIzol plus RNA purification Kit，PrimeScript Reverse Transcriptase和SYBR Green Supermix（生產(chǎn)企業(yè)：大連寶生物有限公司），谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（生產(chǎn)企業(yè)：南京建成生物工程有限公司）。

1.2 實驗動物及分組

本實驗中使用的小鼠均來自于牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境中，溫度控制在（22.0±2.0）℃，飼喂普通飼料，自由進食和進水。在具體實驗過程中，將15只健康狀態(tài)良好且體質(zhì)量為20～25 g的BALB/c小鼠（8周齡）隨機分為肝切除組12只，對照組3只。對照組BALB/c小鼠處理方式為打開腹腔后隨即縫合；而實驗組在進行70%肝切除術(shù)后需要繼續(xù)喂養(yǎng)，并在術(shù)后12 h、24 h、48 h和72 h時分別隨機取3只小鼠處死，其中對照組在假手術(shù)后立即處死。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠的捉拿、麻醉和固定方法

麻醉藥物選用20%烏拉坦，采用0.5 mL/100 mg劑量注射。首先使用手術(shù)鑷夾住小鼠尾部將其從鼠籠中取出，用右手提起小鼠尾后部，轉(zhuǎn)至其眩暈后，將其置于電子秤上的燒杯內(nèi)稱體質(zhì)量，準(zhǔn)確讀取數(shù)值。麻醉時需用右手提起小鼠尾部將其置于鼠籠蓋表面上，此時確保小鼠后肢懸空，僅允許其前肢著地，用左手拇指和食指緊緊抓住小鼠雙耳及其頭頸部的被毛。讓小鼠仰臥位固定于左手中，本實驗可采用腹腔注射，穿刺部位選擇在其左下腹處，麻醉時將注射器針頭與其腹中線成45°，針頭刺入角度應(yīng)與腹部皮膚呈 20°，刺入后緩慢注入藥物。將麻醉好的小鼠仰臥位固定于狗兔二用解剖臺泡沫磚上，四肢用固定繩分別系于泡沫磚側(cè)面的4只大頭釘上。頭部用固定繩系住小鼠門齒固定于泡沫磚一端大頭釘上。

1.3.2 小鼠肝切除手術(shù)操作方法

所有手術(shù)器械手術(shù)前需要進行高壓滅菌。手術(shù)過程中，可先用手術(shù)剪逐一剪去小鼠腹部中線處被毛，充分暴露其腹部皮膚，隨后采用醫(yī)用乙醇對其進行消毒。兩人操作時，一人雙手持止血鉗夾持腹部正中線兩側(cè)的皮膚并盡量向上提起，以防止傷及臟器，另一人用手術(shù)剪自劍突下剪開被毛3 cm，然后同樣用手術(shù)剪自劍突下剪開腹部皮膚和肌肉組織3 cm，使用蚊式止血鉗牽拉腹腔切兩側(cè)，暴露小鼠腹腔后便可清晰見到肝臟。視野下小鼠肝臟可分為四個解剖功能單位，包括中葉、左外葉、右葉和尾葉。分別結(jié)扎并切除肝臟左外葉和中葉，建立70%肝切除小鼠模型。術(shù)后迅速縫合腹部切口，并注射抗生素，待小鼠蘇醒后確保其能正常進食、進水，確保小鼠能夠繼續(xù)存活。

1.3.3 小鼠肝臟體質(zhì)量比測定方法

實驗過程中所有小鼠需要在不同時間點稱量體質(zhì)量，即在術(shù)前和術(shù)后12 h、24 h、48 h和72 h時稱量體質(zhì)量，并在處死后取肝臟稱量質(zhì)量，計算不同時間點肝臟體質(zhì)量比[肝臟相對質(zhì)量 =肝臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%]，隨后將肝臟保存于液氮中，以備后續(xù)RT-qPCR實驗使用。

1.3.4 血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定方法

從小鼠眼球取血，使用肝素鈉抗凝管收集1 mL小鼠血液，隨后立即在4 ℃條件下離心10 min，分離出血清。每只小鼠血清分離出后應(yīng)立即測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT含量，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT含量按照試劑盒操作說明書進行測定。

1.3.5 RT-qPCR法檢測肝組織中Sirt1 mRNA水平

取出對照組和實驗組術(shù)后48 h的肝組織，放入DEPC水預(yù)處理的研缽中，加入液氮快速研磨。采用TRIzol法提取肝組織中的總RNA，利用微量紫外分光光度計（生產(chǎn)企業(yè)：美國Thermo Fisher公司）檢測所得的總RNA濃度和純度。使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過EcoTMReal-Time PCR儀進行RT-qPCR反應(yīng)，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，實驗中所用的引物序列如下。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肝再生過程中肝臟體質(zhì)量比變化

肝臟具有很強的再生能力，本實驗結(jié)果表明，在對實驗組小鼠實施70%肝切除術(shù)后的12～72 h時間范圍內(nèi)，小鼠肝臟體質(zhì)量比隨著時間的延長而逐漸增加，同時也說明在肝再生作用下，小鼠受損傷的肝臟會逐漸得到修復(fù)，與手術(shù)前比較，損傷肝臟的重量也會相應(yīng)逐漸增加。見表1。

2.2 兩組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平變化

大部分谷丙轉(zhuǎn)氨酶存在于肝細胞的胞質(zhì)中，當(dāng)肝臟受到損傷時，胞質(zhì)中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶釋放入血，導(dǎo)致血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高。與此相一致，本實驗結(jié)果表明在小鼠肝臟造成損傷后的12～24 h，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨著時間的延長而逐漸升高；而隨著時間繼續(xù)延長，在損傷后24～72 h，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨著時間的延長而呈逐漸下降趨勢。這些結(jié)果表明，小鼠肝損傷會導(dǎo)致血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高，而在肝再生作用下，小鼠損傷的肝臟會逐漸得到修復(fù)，從而促使血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性逐漸下降，直至恢復(fù)到接近肝臟受損前的水平。見表2。

2.3 兩組小鼠肝組織中Sirt1的mRNA水平變化

通過RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組行70%肝切除術(shù)后48 h，組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶Sirt1的mRNA水平較低；本實驗結(jié)果表明，肝切除會導(dǎo)致組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶Sirt1轉(zhuǎn)錄水平降低，該變化可能與肝再生過程密切相關(guān)。見圖1。

3 討論

肝臟是重要的代謝器官和解毒器官，當(dāng)乙醇或有毒物質(zhì)攝入、自身免疫刺激、病毒性肝炎等多種因素引起肝臟損傷時，處于靜止期的肝細胞進入細胞周期并進行增殖，表現(xiàn)出強大的再生和修復(fù)能力，但是酗酒或慢性病毒性肝炎引起大量肝細胞壞死時，肝臟的再生能力便不足以維持自身功能，導(dǎo)致肝功能衰竭。

組蛋白乙?；怯山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶共同調(diào)控的動態(tài)平衡。乙?；茉鰪娰嚢彼嵘系恼姾?，增加組蛋白與DNA之間的排斥力，激活基因轉(zhuǎn)錄；相反，去乙?；芮宄阴；鶊F，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)由疏松轉(zhuǎn)為致密狀態(tài)，從而導(dǎo)致基因沉默。研究表明，組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶Sirt1參與組蛋白H4K16去乙酰化修飾過程。也有報道證實，組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶Sirt1也能夠參與非組蛋白HMGB1、P53等的去乙?；揎椷^程。綜上所述，組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶Sirt1能夠參與多種生物學(xué)過程，并且發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。在肝臟中，組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶Sirt1能夠調(diào)控并編碼代謝途徑所涉的相關(guān)酶。肝臟中組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶Sirt1的缺失顯著影響了細胞G1/S期的進展，這可能與脂肪酸-β氧化缺陷引起的脂質(zhì)積累有關(guān)。研究證實，Sirt1在小鼠肝再生過程中具有調(diào)節(jié)肝細胞增殖、晝夜節(jié)律和脂質(zhì)代謝的重要作用。近期研究表明，組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶Sirt1參與到肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中。當(dāng)前更多的熱點集中到組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶Sirt1與肝癌及肝再生過程的相關(guān)性研究。70%肝切除會對小鼠肝臟造成損傷，在術(shù)后12 h、24 h、48 h，實驗組ALT活性均高于對照組，與對照組比較，術(shù)后12 h實驗組ALT活性約是對照組的4.5倍，術(shù)后24 h實驗組ALT活性是對照組的6.5倍，術(shù)后48 h實驗組ALT活性是對照組的3.6倍；與對照組比較，術(shù)后72 h，ALT活性基本恢復(fù)到損傷前的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠70%肝切除術(shù)后48 h，Sirt1的mRNA水平降低，因此推測Sirt1的去乙酰化酶活性可能參與了小鼠肝再生過程，為闡明肝損傷后的肝再生過程提供了新的思路。為應(yīng)對各種類型的損傷，肝臟會迅速地做出反應(yīng)，通過再生以恢復(fù)其原來的大小和功能。部分肝切除術(shù)后的肝再生是研究肝細胞增殖最有效的模型之一，涉及復(fù)雜的信號事件以及復(fù)雜的相互作用，許多問題仍需闡明。在切除嚙齒動物2/3的肝臟后，殘留的肝細胞會迅速進入細胞周期，并進行大約兩個周期的細胞分裂。許多因素，包括激素、細胞因子、生長因子及其耦合信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有助于啟動和促進肝細胞通過G1/S期的進展，進入到隨后的細胞分裂。該過程所涉及的相關(guān)基因以不同的時間方式被激活，從而維持了再生過程的效率。此外，特定的代謝變化也與肝臟再生過程有關(guān)。特別是在肝再生過程中發(fā)生了短暫的脂肪變性，這似乎對適當(dāng)?shù)脑偕磻?yīng)很重要，但是其功能尚不明確。Sirt1在哺乳動物正常肝功能的控制中起著核心作用，并參與調(diào)節(jié)包括糖異生、脂肪酸-β氧化和膽固醇等的代謝過程。Sirt1在肝臟中的表達和活性調(diào)節(jié)導(dǎo)致了肝臟晝夜節(jié)律基因表達和代謝的改變，這表明其在維持肝臟代謝和表觀遺傳調(diào)控過程中具有極其重要的作用。然而，組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶Sirt1是如何參與到小鼠肝再生過程中，如何發(fā)揮作用，需要進一步展開深入的研究和探討，以期為今后的臨床研究工作提供更加詳實的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。