改良化學(xué)沉淀法和過氧化物酶法檢測冠心病患者血清小而密低密度脂蛋白的方法學(xué)比較

解晨曦 畢 波

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊 830011

冠心病指由于冠狀動脈供血不足，致使心肌 壞死、缺血，導(dǎo)致心臟收縮力減弱、順應(yīng)性降低等功能障礙類心血管疾病，已成為嚴(yán)重威脅患者生命安全的疾病之一[1-2]。低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）作為公認(rèn)的冠心病危險(xiǎn)因素，其在顆粒大小、密度與物理化學(xué)性質(zhì)等方面具有異質(zhì)性[3-4]。將其按照顆粒大小不同，可分為小而密LDL（small dense low density lipoprotein，sdLDL）和大而輕LDL（large and light low density lipoprotein，IbLDL）。sdLDL可作為冠心病的首要脂類危險(xiǎn)因素[5]。當(dāng)前sdLDL的檢驗(yàn)方法包括梯度凝膠電泳法、密度梯度超速離心法、化學(xué)沉淀法和過氧化物酶法，但梯度凝膠電泳法分析速度慢，且操作繁瑣，密度梯度超速離心法所需時(shí)間長，且檢測儀器昂貴。本研究選擇應(yīng)用較多的過氧化物酶法和肝素鎂沉淀法進(jìn)行比較。但國內(nèi)對肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測冠心病患者血清sdLDL的相關(guān)研究較少，基于此，本研究通過對82例冠心病患者sdLDL進(jìn)行分析，探討肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取82例新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院2021年1—8月收治的冠心病患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①冠心病診斷參照《心血管內(nèi)科學(xué)》[6]，經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心病；認(rèn)知功能正常者；依從性良好者；臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有高血壓致左心室肥厚者：合并持續(xù)性室速、房顫等嚴(yán)重心律失常者；合并嚴(yán)重感染性疾病者。其中男45例，女37例；年齡55～70歲，平均（62.56±4.67）歲；疾病類型：穩(wěn)定型心絞痛31例，心肌梗死21例，不穩(wěn)定型心絞痛30例。本研究全部冠心病患者簽署診療知情同意書，課題立項(xiàng)已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

入院后，對全部患者均行常規(guī)檢查，并記錄身體相關(guān)指標(biāo)。抽取冠心病患者空腹靜脈血，進(jìn)行離心（3500 r/min，15 min），分離血清，采用AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼，粵械注準(zhǔn)：20162220214），三酰甘油（triacylglycerol，TG）與總膽固醇（total cholesterol，TC）使用貝克曼試劑，LDL使用上海藍(lán)怡試劑，sdLDL-C過氧化物酶法使用寧波美康生物試劑（批號：085813），相關(guān)步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。sdLDL-C過氧化物酶法使用特定的離子選擇劑和酶，并排除其他脂蛋白膽固醇的干擾，和特定的sdLDL-C選擇性反應(yīng)。首先，在離子選擇劑作用下，對sdLDL-C以外的脂蛋白選擇性抑制，并將非sdLDL-C成分清除干凈。使sdLDL-C在膽固醇氧化酶與膽固醇酯酶作用下，生成過氧化氫，并在過氧化物酶作用下，和色原生成紫紅色酶類物質(zhì)，進(jìn)而檢驗(yàn)sdLDL-C水平。取3 μl血清，與150 μl試劑1[膽固醇酯酶1.5 KU/L，磷酸鹽緩沖液100 mmol/L，磷脂酶2.5 KU/L，膽固醇氧化酶1 KU/L，過氧化物酶6 KU/L，N-乙基-N-（2-羥基3-磺丙基）3-甲基苯胺鈉鹽1.78 mmol/L，1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸鹽0.1 ml/L]混勻，37° C孵育5 min，讀取吸光度。并與50 μl試劑2（4-氨基安替比林2.5 mmol/L，磷酸鹽緩沖液100 mmol/L，乙二按四乙酸50 mmol/L）混勻，37℃孵育5 min，讀取吸光度，計(jì)算sdLDL-C。

肝素鎂沉淀法：將200 μl肝素鎂沉淀劑與200 μl血清加入離心管中，混合均勻，在37℃條件下，水浴10 min，隨后冰浴15 min。在4℃條件下進(jìn)行離心處理（16 600 r/min，15 min）。通過全自動生化分析儀檢驗(yàn)上清液LDL-C濃度，即為血清sdLDL-C濃度。

1.3 觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①sdLDL-C精密度分析：選擇sdLDL-C濃度為2.57、1.42、0.21 mmol/L高、中、低水平的樣品各1份，每日檢測2次，每次均檢測2遍，共檢測20 d。根據(jù)美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）EP5-T2文件[7]評價(jià)精密度。②線性分析：取1高值標(biāo)本（sdLDL-C濃度為2.56 mmol/L）和1低值標(biāo)本（sdLDL-C濃度為0.15 mmol/L），等量混勻后，制備為中值標(biāo)本（sdLDL-C濃度為1.36 mmol/L），將中值標(biāo)本分別與高、低值標(biāo)本等量混勻后，制備的sdLDL-C濃度分別為1.96、0.76 mmol/L。將上述5個(gè)標(biāo)本分別使用肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定4次，根據(jù)NCCLS（EP6-P）的相關(guān)評價(jià)方案進(jìn)行線性分析。③肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定sdLDL-C水平的結(jié)果：選擇患者血清82份，sdLDL-C濃度為0.10～2.59 mmol/L，分別使用肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測sdLDL-C水平，并根據(jù)NCCLS（EP9-P）評價(jià)方案進(jìn)行方法學(xué)比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果數(shù)據(jù)納入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較用方差分析；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測sdLDL-C精密度分析

過氧化物酶法和肝素鎂沉淀法檢測sdLDL-C，批間、批內(nèi)、總變異系數(shù)均<2.972%，精密度較好，見表1。

表1 改良化學(xué)沉淀法和過氧化物酶法檢測sdLDL-C精密度分析（n=43）

2.2 線性分析

線性回歸方程分別為肝素鎂沉淀法：Y=0.973X+0.025；過氧化物酶法：Y=0.991X+0.023，sdLDL-C水平處于0.10～2.59 mmol/L時(shí)，線性良好，肝素鎂沉淀法與過氧化物酶法均有良好的相關(guān)性，且呈正直線關(guān)系（P< 0.05）。

2.3 肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定sdLDL-C水平的結(jié)果比較

肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定sdLDL-C水平（TG值<4.0 mmol/L）結(jié)果表明，過氧化物酶法測定sdLDL-C水平為（1.18±0.19）mmol/L，肝素鎂沉淀法測定sdLDL-C水平為（1.21±0.20）mmol/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.137，P=0.856）。

3 討論

冠心病的病機(jī)較為復(fù)雜，其中血栓形成和心血管動脈粥樣硬化在冠心病演變過程中具有重要作用，脂類代謝紊亂為常見表現(xiàn)[8-9]。血清LDL是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素，隨著研究的逐漸深入，sdLDL作為LDL亞組之一，已成為脂質(zhì)代謝的研究重點(diǎn)，其與冠心病密切相關(guān)[10-11]。因此，檢測血清sdLDL-C對冠心病的診治具有重要作用[12-13]。

sdLDL-C作為LDL-C的主要成分，半衰期較長，和sdLDL-C受體親和性不高，對患者血管壁侵入性較高，且對氧化應(yīng)激耐受性較低，可作為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[14-15]。肝素鎂沉淀法作為一種通過投加肝素鎂沉淀劑，使血液中需要去除的溶解物質(zhì)轉(zhuǎn)化為難溶物質(zhì)而析出的處理方式，和傳統(tǒng)化學(xué)沉淀法相比，具有樣本用量少、無需特殊儀器、價(jià)格低廉和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，更適用于血清sdLDL-C水平檢測[16]。而過氧化物酶法檢測使用特定的離子選擇劑和酶，并排除其他脂蛋白膽固醇的干擾，和特定的sdLDL-C選擇性反應(yīng)，后使用酶法定量檢測其含量。優(yōu)點(diǎn)在于可直接檢測sdLDL-C，受其他脂蛋白膽固醇干擾小，同時(shí)不含鎂離子，對儀器基本沒有損傷，適用于多種生化分析儀[17]。本研究結(jié)果顯示，過氧化物酶法和肝素鎂沉淀法檢測sdLDL-C，批間、批內(nèi)、總變異系數(shù)均<2.972%，精密度較好，提示過氧化物酶法檢測冠心病患者血清sdLDL-C的精密度較高，有利于為冠心病的診治和預(yù)后評估，為其提供相應(yīng)參考依據(jù)[18]，線性回歸方程分別為肝素鎂沉淀法：Y=0.973X+0.025，過 氧 化 物 酶 法：Y=0.991X+0.023，sdLDL-C水 平處于0.10～2.59 mmol/L時(shí)，線性良好，肝素鎂沉淀法與過氧化物酶法均有良好的相關(guān)性，且呈正直線關(guān)系（P< 0.05），提示過氧化物酶法與肝素鎂沉淀法相比較，TG值<4.0 mmol/L時(shí)，對于結(jié)果檢測的相關(guān)性良好，而TG值>4.0 mmol/L時(shí)，不利于使用F計(jì)算法。肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定LDL-C水平（TG值<4.0 mmol/L）結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），提示TG值<4.0 mmol/L時(shí)，肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定結(jié)果均不受TG值影響，TG值>4.0 mmol/L時(shí)，肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定結(jié)果有一定差異。通過肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測冠心病患者血清sdLDL-C，有利于為臨床提供可靠的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)而指導(dǎo)冠心病篩查與治療。但本研究仍存在不足之處，如研究樣本數(shù)量較少，不能對肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測冠心病患者sdLDL-C的精密度做出準(zhǔn)確判斷，因此，臨床可擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行研究，以進(jìn)一步提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上，肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法的相關(guān)性良好，對于冠心病患者血清sdLDL-C均有較好的檢測效果，但過氧化物酶法更為快速、簡便，更有助于sdLDL檢測標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)施，值得臨床廣泛推廣。