系統(tǒng)性紅斑狼瘡B細(xì)胞差異表達(dá)基因生物信息學(xué)分析

黃 晶 郜趙偉 郭文濤 董 軻

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710038

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是中青年女性常見自身免疫病之一，可累及全身各系統(tǒng)。免疫失調(diào)既是SLE患者主要臨床表現(xiàn)之一，也是其發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)要素。SLE患者免疫失調(diào)表現(xiàn)多樣，包括B細(xì)胞[1-2]、T細(xì)胞[3]、單核-巨噬細(xì)胞[4]等多種免疫細(xì)胞異常。其中B細(xì)胞免疫異常是SLE研究熱點(diǎn)之一。SLE治療藥物Belimumab通過(guò)靶向B淋巴細(xì)胞刺激因子，抑制B細(xì)胞生存及其向漿細(xì)胞分化，緩解病情[5]。因此，B細(xì)胞異常在SLE發(fā)生發(fā)展中作用關(guān)鍵。本研究篩選SLE患者B細(xì)胞差異表達(dá)基因，并進(jìn)行功能分析，為探討SLE發(fā)病機(jī)制和篩選潛在治療靶點(diǎn)提供參考。

1 資料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集

GSE4588數(shù)據(jù)集包括7例SLE患者和9例健康者B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息；GSE10325數(shù)據(jù)集包括14例SLE患者和9例健康者B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息；GSE30153數(shù)據(jù)集包括17例SLE患者和9例健康者B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息。

1.2 差異表達(dá)基因篩選

利用GEO2R分析工具篩選各數(shù)據(jù)集中SLE患者B細(xì)胞差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs），對(duì)照為健康者B細(xì)胞。DEGs篩選條件：|Log2FC|≥1且P< 0.01，F(xiàn)C：Fold change。通過(guò)對(duì)3組DEGs取交集得到共有DEGs。

1.3 DEGs功能分析

利用DAVID分析工具對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體（GO）注釋和KEGG通路分析，利用R軟件制作氣泡圖對(duì)GO和KEGG分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）分析

利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs編碼蛋白進(jìn)行PPI構(gòu)建，篩選聯(lián)合評(píng)分> 0.4的中置信度互作節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

DEGs利用t檢驗(yàn)的P值和差異倍數(shù)進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：|Log2FC|≥1及P< 0.01。對(duì)DEGs進(jìn)行GO及KEGG分析，雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者B細(xì)胞DEGs

根據(jù)DEGs篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別在GSE4588、GSE30153及GSE10325數(shù)據(jù)集中篩選到1608（621上調(diào)，987下調(diào)）、62（56上調(diào)，6下調(diào)）和366（190上調(diào)，176下調(diào)）個(gè)DEGs（圖1A）。取交集后，共篩選到9個(gè) 共 有DEGs：USP18、RRM2、OAS3、MAN1A1、IFITM1、IFI44L、IFI44、CD38及CD1C（圖1B）。其中，8個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，CD1C表達(dá)下調(diào)（圖1C）。

圖1 SLE患者B細(xì)胞DEGs篩選

2.2 共有DEGs的功能分析

上述DEGs參與的生物學(xué)過(guò)程（GO_BP）包括：對(duì)病毒的響應(yīng)、病毒防御、病毒基因組復(fù)制負(fù)調(diào)控、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路。KEGG通路分析顯示DEGs參與造血細(xì)胞譜系（圖2）。

圖2 SLE患者B細(xì)胞DEGs的GO和KEGG分析結(jié)果

2.3 DEGs編碼蛋白互作分析

在9個(gè)DEGs編碼蛋白中：RRM2及MAN1A1與其他7個(gè)DEGs無(wú)互作關(guān)系；CD1C和CD38之間存在互作，與其他7個(gè)DEGs無(wú)互作；IFI44、OAS3、IFI44L、IFITM1及USP18彼此之間存在互作關(guān)系（圖3）。

圖3 SLE患者B細(xì)胞DEGs編碼蛋白PPI分析

3 討論

SLE患者出現(xiàn)抗核抗體、抗dsDNA抗體等多種自身抗體，表明B細(xì)胞免疫反應(yīng)的異常[6-8]。因此，鑒定SLE患者B細(xì)胞異常表達(dá)基因，對(duì)SLE發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)研發(fā)具有重要價(jià)值。本研究共篩選到8個(gè)表達(dá)上調(diào)基因（USP18、RRM2、OAS3、MAN1A1、IFITM1、IFI44L、IFI44及CD38）及1個(gè)表達(dá)下調(diào)基因（CD1C）。其中，IFI44、OAS3、IFI44L、IFITM1及USP18彼此間存在蛋白互作，為核心DEGs。功能分析表明DEGs主要與機(jī)體對(duì)病毒感染的響應(yīng)相關(guān)。

USP18是一種干擾素信號(hào)通路抑制分子，可以特異性地將ISG15從其底物蛋白上切割，從而保護(hù)蛋白不受降解。USP18基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化的易感性相關(guān)[9]。Yang等[10]研究顯示USP18缺失可以上調(diào)小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的細(xì)胞分化。由于多項(xiàng)研究表明SLE體內(nèi)Treg水平顯著下調(diào)[11-13]，因此，USP18上調(diào)可能對(duì)SLE發(fā)生具有重要作用。然而，B細(xì)胞USP18上調(diào)的作用尚待進(jìn)一步研究。RRM2在DNA復(fù)制、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。RRM2在SLE中的作用尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者B細(xì)胞RRM2表達(dá)上調(diào)，可能與B細(xì)胞的異常增殖活化相關(guān)，還需深入研究。

干擾素信號(hào)通路在SLE發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。本研究篩選的DEGs：OAS3、IFITM1、IFI44L及IFI44均為干擾素誘導(dǎo)蛋白。OAS3可以降解病毒RNA，文獻(xiàn)研究[8，14]結(jié)果顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA—MALAT1可通過(guò)上調(diào)OAS2、OAS3及OASL促進(jìn)SLE病情進(jìn)展，表明OAS3在SLE發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)研究[15-16]表明IFI44L甲基化水平在伴有腎損傷SLE患者中顯著低于無(wú)腎損傷SLE患者，在康復(fù)期SLE患者中顯著高于活動(dòng)期SLE患者，表明IFI44L甲基化水平降低可能促進(jìn)SLE病情進(jìn)展。由于甲基化水平往往與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示IFI44L表達(dá)升高可能促進(jìn)SLE發(fā)展。此外，Shen等[17]報(bào)道IFI44可能是狼瘡性腎炎（LN）的關(guān)鍵基因，對(duì)該病具有一定的診斷價(jià)值。Lood等[18]發(fā)現(xiàn)SLE患者血小板中IFITM1表達(dá)顯著上調(diào)，并促進(jìn)血管系統(tǒng)受累，提示IFITM1在促進(jìn)SLE病情進(jìn)展中作用關(guān)鍵。

CD38參與核苷酸代謝，目前已有多項(xiàng)治療腫瘤的CD38靶向藥物上市或處于臨床試驗(yàn)中[19-20]。研究顯示CD38缺失小鼠的自身免疫性炎癥水平顯著降低，提示CD38可作為控制自身免疫反應(yīng)的治療靶點(diǎn)[21]。Cole等[22]研究結(jié)果顯示，達(dá)雷妥尤單抗是一種CD38單抗藥物，在體外能夠耗盡SLE和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的漿細(xì)胞，提示CD38靶向治療對(duì)SLE患者有潛在價(jià)值。

CD1C屬于非多態(tài)性抗原呈遞蛋白家族分子，表達(dá)于B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。Yuan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，SLE和狼瘡性腎炎患者體內(nèi)CD1C+樹突狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少，利用間充質(zhì)干細(xì)胞治療可以通過(guò)增加CD1C+樹突狀細(xì)胞數(shù)量，緩解病情。然而，CD1C+B細(xì)胞在SLE中的作用尚待進(jìn)一步研究。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，各類疾病的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)愈加豐富，已成為篩選疾病關(guān)鍵基因和潛在治療靶點(diǎn)的重要資源。SLE患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜，目前的治療手段和靶點(diǎn)仍然較少，篩選更多新型治療靶點(diǎn)對(duì)SLE患者具有重要臨床意義。本研究利用SLE患者B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出9個(gè)差異表達(dá)基因，為SLE發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論參考。下一步需要對(duì)其中多個(gè)基因的功能，尤其是對(duì)B細(xì)胞免疫的調(diào)控作用進(jìn)行深入研究，以揭示其在SLE發(fā)病中的作用及其潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。