生長激素改善預(yù)后不良患者IVF助孕結(jié)局的分析

唐奕，胡嫦娥，彭揚(yáng)琴，屈競斐，林戈，龔斐*

(1.中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所，長沙 410078；2.中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院，長沙 410078)

對于體外受精(IVF)周期無獲卵、胚胎質(zhì)量差導(dǎo)致臨床結(jié)局不良的患者，目前臨床上暫無特別有效的治療方法。隨著對生殖生理各個環(huán)節(jié)的深入研究，人們逐漸認(rèn)識到促性腺激素(Gn)并非是調(diào)節(jié)卵巢功能的唯一用藥，生長激素(GH)及各種肽生長因子對卵巢和卵泡發(fā)育也具有重要的意義。GH可以直接與卵巢局部GH受體結(jié)合或間接上調(diào)局部胰島素樣生長因子-1的合成來調(diào)節(jié)促卵泡生成素(FSH)，并與Gn協(xié)同作用，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞內(nèi)芳香化酶活性，促進(jìn)甾體激素的合成，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育[1]。顆粒細(xì)胞上FSH受體及促黃體生成素(LH)受體的表達(dá)是卵泡發(fā)育的關(guān)鍵，研究顯示，GH能提高高齡患者顆粒細(xì)胞中GH受體、FSH受體和LH受體的表達(dá)量，增加卵母細(xì)胞對Gn的敏感性，促進(jìn)卵泡發(fā)育，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，最終提高妊娠率和活產(chǎn)率[2]。本研究通過回顧性分析本中心既往出現(xiàn)無獲卵以及胚胎質(zhì)量差導(dǎo)致臨床結(jié)局不良的患者接受 GH小劑量長程預(yù)處理治療前后的妊娠結(jié)局，探討GH在改善胚胎質(zhì)量及臨床妊娠結(jié)局方面的療效。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2019年12月至2021年7月在中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院進(jìn)行IVF助孕臨床結(jié)局不良的患者，包括前次IVF助孕周期無可用卵母細(xì)胞以及胚胎質(zhì)量差患者(優(yōu)質(zhì)胚胎率≤20%)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次IVF助孕因無獲卵、胚胎質(zhì)量差(優(yōu)質(zhì)胚胎率≤20%)導(dǎo)致助孕失??；(2)首次IVF助孕未接受GH藥物輔助治療，之后接受GH預(yù)治療；(3)月經(jīng)周期規(guī)律25～30 d；(4)體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≤28 kg/m2；(5)基礎(chǔ)FSH、LH、雌二醇(E2)、睪酮(T)水平處在正常范圍內(nèi)；(6)既往HCG日或移植日內(nèi)膜厚度≥7 mm。

排除標(biāo)準(zhǔn)：前次受精失敗及其他妊娠不利因素，如粘膜下子宮肌瘤、中重度宮腔粘連、內(nèi)膜結(jié)核、子宮畸形、嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病以及男性重度弱精子癥、畸形精子癥等。

本研究共納入479例患者，比較患者GH預(yù)處理前后兩個周期的相關(guān)指標(biāo)。

二、研究方法

1.促排卵方案：促排卵方案選擇拮抗劑方案和黃體期長方案，方案調(diào)整的參考指標(biāo)包括抗苗勒管激素(AMH)、竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)、FSH和年齡。

拮抗劑方案促排卵：于月經(jīng)周期第2～3天接受B超和內(nèi)分泌檢查，開始以Gn(金賽恒，長春金賽藥業(yè))150～300 U促排卵，連續(xù)用3 d后，每日或隔日B超監(jiān)測卵泡生長情況及激素變化，以調(diào)整促性腺激素用量，當(dāng)出現(xiàn)1個卵泡直徑≥12 mm時，加用拮抗劑(加尼瑞克，默沙東，德國)0.25 mg每日注射直至HCG日，當(dāng)出現(xiàn)至少2～3個卵泡直徑≥18 mm或僅有的1～2個卵泡≥17 mm時，當(dāng)晚皮下注射絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)5 000～10 000 U及GnRH-a(達(dá)必佳，輝凌，德國)200 μg扳機(jī)，于HCG日35～36 h后經(jīng)陰道B超下取卵。

GnRH-a長方案促排卵：黃體中期予GnRH激動劑(醋酸曲普瑞林，益普生，法國)1.5 mg降調(diào)14 d后，以Gn150～300 U促排卵，連續(xù)用3～4 d后，每日或隔日B超監(jiān)測卵泡生長情況及激素變化，以調(diào)整促性腺激素用量，當(dāng)出現(xiàn)至少2～3個卵泡直徑≥18 mm或僅有的1-2個卵泡≥17 mm時，當(dāng)晚皮下注射絨毛膜促性腺激素5 000～10 000 U扳機(jī)，于HCG日35～36 h后經(jīng)陰道B超下取卵。

2.生長激素預(yù)處理：促排啟動日前兩個月經(jīng)周期的黃體中期，患者開始接受重組人生長激素(賽增，2 IU/支，長春金賽藥業(yè))2 IU/d，至促排卵開始后劑量改為4 IU/d直至HCG日結(jié)束。

3.受精及胚胎評分：取卵后行IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)16～18 h觀察受精情況。胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)卵裂球大小均勻與否及無核碎片量的多少進(jìn)行胚胎質(zhì)量評級，將胚胎分為4級。Ⅰ級：胚胎卵裂球連接良好，大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，無顆粒，碎片≤5%。Ⅱ級：卵裂球形態(tài)規(guī)則或輕度不規(guī)則，大小均勻或稍欠均勻，可有顆粒，碎片≤20%。Ⅲ級：卵裂球胚胎內(nèi)碎片少于50%，碎片外卵裂球形態(tài)同Ⅱ級，具有一定折光性，透明帶完整。Ⅳ級：胚胎內(nèi)碎片≥50%，碎片外卵裂球具有生存活力。根據(jù)這個評級標(biāo)準(zhǔn)，將第3日(D3)為Ⅱ級6細(xì)胞以上的胚胎評為優(yōu)質(zhì)胚胎。

4.胚胎移植及黃體支持：取卵3～5 d后在腹部超聲引導(dǎo)下進(jìn)行胚胎移植術(shù)，取卵日常規(guī)使用黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾同，90 mg/支，默克雪蘭諾，瑞士)1支/d，進(jìn)行黃體支持。移植后2周測定血β-HCG(HCG>5 U/L為陽性)，移植28 d后超聲檢查提示孕囊或流產(chǎn)物檢查見絨毛者診斷為臨床妊娠。

三、觀察指標(biāo)

1.主要研究指標(biāo)：D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)。

2.次要研究指標(biāo)：Gn總量、Gn天數(shù)、扳機(jī)日內(nèi)分泌激素(E2、P、LH)水平、扳機(jī)日內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、D5囊胚數(shù)、D6囊胚數(shù)、D7囊胚數(shù)、因卵母細(xì)胞因素取消周期率、因胚胎因素取消周期率、臨床妊娠率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期總數(shù)×100%；因卵母細(xì)胞因素取消周期率=(無獲卵+無成熟卵+獲異常卵周期數(shù))/取卵周期數(shù)×100%；因胚胎因素取消周期率=無可移植胚胎周期數(shù)(排除無獲卵+無成熟卵+獲異常卵+全部異常受精周期數(shù))/取卵周期數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者基本資料

共納入479例患者，平均年齡34.65±4.72歲，BMI 21.49±2.09 kg/m2，AMH水平2.90±2.64 ng/ml，不孕年限4.11±3.04年。GH干預(yù)前后周期的受精方式(IVF/ICSI)無變化?；颊卟皇褂肎H的周期和使用GH的治療周期間隔不超過半年。

使用GH預(yù)處理周期與前一周期相比較，HCG日的血清激素水平、內(nèi)膜厚度及≥12 mm的卵泡個數(shù)均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者使用GH干預(yù)前后HCG日血清激素水平及子宮內(nèi)膜情況

二、患者使用GH干預(yù)前后的促排卵情況及臨床結(jié)局

與干預(yù)前的周期相比，患者接受GH干預(yù)后，移植胚胎數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、D7天囊胚數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；使用GH周期的Gn促排天數(shù)、Gn總量顯著減少，獲卵數(shù)顯著增多，D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，D5、D6天囊胚數(shù)均顯著增多(P<0.05)；GH干預(yù)后，移植周期數(shù)173例，臨床妊娠率39.88%，干預(yù)前移植周期數(shù)156例，臨床妊娠率7.05%，臨床妊娠率顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2 患者使用GH干預(yù)前后的促排卵、胚胎情況及臨床妊娠比較

三、使用GH干預(yù)前后的取消移植周期原因比較

GH干預(yù)前，479例患者取消移植周期323個，干預(yù)后，有306取消移植周期。比較患者GH干預(yù)前后兩個周期中取消移植的原因，結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞因素取消周期率在干預(yù)前后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；使用GH干預(yù)后，因胚胎因素取消周期率顯著降低(P<0.001)，而因其他原因取消周期數(shù)在使用GH的周期中顯著增多(P<0.001)(表3)。

表3 GH干預(yù)前后患者取消移植周期的原因比較[n(%)]

四、按照前一周期不同獲卵數(shù)分組患者GH干預(yù)后的獲卵數(shù)及優(yōu)胚數(shù)比較

479例患者按照前一周期獲卵數(shù)分為3組：≤3枚組(n=92)、4～9枚組(n=226)和≥10枚組(n=161)，比較各組GH干預(yù)后獲卵數(shù)變化。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與GH干預(yù)前相比，3組的D3優(yōu)胚數(shù)均顯著增加(P<0.001)；前一周期獲卵數(shù)≤3枚組患者的獲卵數(shù)顯著增加(P<0.001)，但Gn總量和Gn天數(shù)無顯著性變化(P>0.05)；前一周期獲卵數(shù)4～9枚組患者，Gn總量顯著減少，Gn天數(shù)顯著縮短(P<0.001)，但獲卵數(shù)沒有顯著性差異(P>0.05)；前一周期獲卵數(shù)≥10枚組，Gn天數(shù)顯著變短(P<0.001)，但Gn總量及獲卵數(shù)無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 按前一周期獲卵數(shù)分組情況比較

討 論

胚胎質(zhì)量是決定移植成功的關(guān)鍵因素[3]。研究表明，劣質(zhì)胚胎移植會導(dǎo)致更高的流產(chǎn)率和較低的持續(xù)妊娠率[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中，均為劣質(zhì)胚胎的周期發(fā)生率約占12%[5]。如何改善此類患者的胚胎質(zhì)量，進(jìn)而提高IVF助孕的成功率，目前是一個棘手的問題。

眾所周知，胚胎的質(zhì)量與卵母細(xì)胞及精子質(zhì)量密切相關(guān)，其中卵母細(xì)胞質(zhì)量是影響胚胎發(fā)育的重要因素[6]。從始基卵泡到初級卵泡的啟動募集、竇前卵泡向竇狀卵泡發(fā)育、竇狀卵泡到成熟卵泡排卵的過程，GH均扮演了重要的角色[1]。研究證實(shí)[7]，高齡婦女卵母細(xì)胞表面GH受體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)功能性線粒體的數(shù)量明顯低于年輕女性。當(dāng)給高齡女性添加GH治療后，功能線粒體的數(shù)量顯著升高。同樣，Li等[8]的研究發(fā)現(xiàn) 對于至少有一個IVF周期失敗并且沒有高質(zhì)量的胚胎(1級或2級)的患者，添加GH能顯著提高其卵裂期胚胎數(shù)、臨床妊娠率、活產(chǎn)率及卵泡顆粒細(xì)胞線粒體DNA的數(shù)量。Gong等[9]對卵巢低反應(yīng)(POR)患者運(yùn)用GH 4 IU/d預(yù)處理6周，能夠顯著降低卵泡顆粒細(xì)胞中的活性氧的水平，減少線粒體DNA的損傷，最終提高優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量。線粒體是卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育過程中極其重要的細(xì)胞器，它為兩者的發(fā)育提供足夠的能量。而GH可以直接和卵母細(xì)胞表面的生長激素受體結(jié)合發(fā)揮作用，提高功能線粒體的數(shù)量，最終提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。

同時，顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞發(fā)育中也扮演著重要角色，主要發(fā)揮營養(yǎng)支持和調(diào)控兩方面重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)將小鼠竇前卵泡取出后進(jìn)行體外培養(yǎng)，添加GH可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[10]。將高齡不孕女性的卵泡取出，在體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)添加GH可以明顯提高顆粒細(xì)胞表面的FSH受體、LH受體及GH受體的表達(dá)量，進(jìn)而增加卵母細(xì)胞對Gn的敏感性，促進(jìn)卵泡發(fā)育，最終提高卵母細(xì)胞質(zhì)量[2]?？p隙連接蛋白是顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間進(jìn)行小分子代謝底物交換的橋梁，如果縫隙連接表達(dá)缺失，最終會導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡、卵泡閉鎖等。所以，縫隙連接蛋白在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中扮演著重要的角色。一項(xiàng)動物研究表明：添加GH可以促進(jìn)卵泡早期發(fā)育中connexin-43蛋白(縫隙連接亞單位)表達(dá)增加[11]。因此，GH有可能利于提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，進(jìn)而改善胚胎質(zhì)量，進(jìn)一步提高臨床妊娠率。本研究納入既往IVF助孕周期中無可用卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量差的患者進(jìn)自身前后對照分析。結(jié)果顯示：給予GH小劑量長程預(yù)處理治療后，患者使用Gn天數(shù)顯著減少，Gn總量有所減少的情況下，獲卵數(shù)增加；且D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、D5和D6囊胚數(shù)明顯增多；添加GH治療后臨床妊娠率較治療前顯著增加，前期一些研究結(jié)果基本一致。Chen等[12]對先前的IVF周期中未懷孕的卵巢儲備功能低下的患者進(jìn)行GH 劑量為2 IU/d預(yù)處理4周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加GH組患者，最終的獲卵數(shù)增加，并且累積臨床妊娠率更高。唐莉等[13]研究發(fā)現(xiàn)POR患者行IVF助孕添加GH有助于改善卵巢反應(yīng)和臨床結(jié)局。本研究考慮到獲卵數(shù)是影響妊娠結(jié)局的重要因素，所以根據(jù)前次獲卵數(shù)進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示：前次周期獲卵數(shù)≤3枚組，經(jīng)過GH治療后獲卵數(shù)及D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著提高(P<0.001)；在前次獲卵數(shù)4～9枚組和前一周期獲卵數(shù)≥10枚組中，經(jīng)過GH治療未見獲卵數(shù)有顯著增加，只有D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)較GH干預(yù)前顯著增加(P<0.001)。進(jìn)一步分析了3組患者的Gn使用量和Gn使用天數(shù)，發(fā)現(xiàn)前次周期獲卵數(shù)≤3枚組在GH干預(yù)前后后Gn用量和天數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說明在Gn用量和Gn天數(shù)無差異的條件下，GH治療確實(shí)改善了此組人群的獲卵數(shù)和D3優(yōu)胚數(shù)。而前次獲卵數(shù)4～9枚組和前一周期獲卵數(shù)≥10枚組，Gn使用的總劑量無顯著差異，但添加GH后Gn使用天數(shù)顯著縮短(P<0.001)。這個結(jié)果有以下2種可能性：(1)GH促進(jìn)顆粒細(xì)胞表面FSH及LH受體的表達(dá)量，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞對Gn的敏感性，進(jìn)而縮短了用藥時間。(2)在添加GH的周期，如果Gn使用總量前后無差異，Gn促排天數(shù)縮短，那有可能是增加了每日Gn的使用量，最終導(dǎo)致了Gn使用天數(shù)縮短。因本研究為自身前后對照研究，個別患者在下一個治療周期中，促排方案及促排劑量上有了一些調(diào)整，增加了前后對照的干擾因素。但本研究僅納入拮抗劑方案和激動劑長方案兩種超促排卵方案，既往有Mate分析顯示：在低預(yù)后人群中，使用拮抗劑方案和激動劑長方案進(jìn)行超促排卵最終的獲卵數(shù)、臨床妊娠率無顯著差異[14]。在ESHRE的指南中同樣提到：在卵巢低反應(yīng)人群中，GnRH激動劑和GnRH拮抗劑方案之間在安全性和療效方面沒有差異[15]。在本研究中個別患者的促排方案做了調(diào)整，但也是在黃體期長方案和拮抗劑方案之間的調(diào)換，所以認(rèn)為本研究因?yàn)榇倥怕逊桨覆煌瑢ψ罱KIVF助孕結(jié)局的分析帶來的干擾可以暫不考慮。另外，本研究未設(shè)置未使用GH治療的平行對照組，這些均為本研究的局限性。但通過本次回顧性分析，我們發(fā)現(xiàn)小劑量長程的GH預(yù)處理治療可能為前次促排卵周期無獲卵、無優(yōu)質(zhì)胚胎的患者找到提高獲卵數(shù)、改善胚胎質(zhì)量，進(jìn)而提高臨床妊娠率的新方法。

目前關(guān)于GH是否能提高低預(yù)后患者的妊娠率和活產(chǎn)率是存在爭議的。一些Meta分析證實(shí)GH可以提高妊娠率和活產(chǎn)率[16-18]，但這些Meta分析中納入的RCT研究人群異質(zhì)性較大，存在POR診斷標(biāo)準(zhǔn)不一致，GH治療劑量、用法以及運(yùn)用時機(jī)不一致，促排卵方案不一致等問題。Zhu等[19]運(yùn)用波塞冬標(biāo)準(zhǔn)對POR進(jìn)行診斷，明顯減小了因?yàn)槟挲g導(dǎo)致的人群異質(zhì)性，該研究顯示GH未能提高新鮮胚胎移植后的妊娠率和活產(chǎn)率，但由于該研究是回顧性研究，在IVF治療過程中是否使用GH是根據(jù)醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，以及患者的經(jīng)濟(jì)承受力決定，所以，可能會存在患者選擇偏倚。Cai等[20]運(yùn)用GH預(yù)處理6周治療符合波塞冬診斷標(biāo)準(zhǔn)的卵巢儲備功能低下的患者，發(fā)現(xiàn)在波塞冬3組中，未見到添加GH有明顯的獲益；但在波塞冬4組，即年齡≥35歲的低儲備患者，添加GH可以明顯提高優(yōu)質(zhì)胚胎的數(shù)量、同時降低流產(chǎn)率、提高活產(chǎn)率。

綜上所訴，GH小劑量長期預(yù)處理可以使無獲卵或無優(yōu)質(zhì)胚胎的結(jié)局不良患者在下次進(jìn)行IVF助孕時獲卵數(shù)增多、胚胎質(zhì)量得到改善，最終獲得較多的優(yōu)質(zhì)胚胎，進(jìn)一步提高臨床妊娠率。但GH的確切應(yīng)用價值尚待擴(kuò)大樣本量及高質(zhì)量的前瞻性隨機(jī)雙盲對照試驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。