影響不明原因不孕患者體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的多因素分析

林琳，劉蕓，黃吳健，陳國勇

(福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院 聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，福州 320025)

隨著社會(huì)與環(huán)境因素的變化，人們的生活方式也發(fā)生了明顯改變，不孕人群的數(shù)量也越來越多。在不孕患者中有相當(dāng)一部分的不明原因不孕(UI)，國外報(bào)道UI的發(fā)病率約8%～37%[1]。UI夫婦往往擁有正常的輸卵管、正常的精液參數(shù)、正常的排卵功能，卻缺乏可識(shí)別的不孕原因[2-4]。因診斷標(biāo)準(zhǔn)有分歧，UI相關(guān)的高水平的臨床研究并不多。本研究通過回顧性分析UI女性患者在體外受精(IVF)助孕過程中臨床特征，探討相關(guān)因素對(duì)UI患者妊娠結(jié)局的影響，為改善UI患者的妊娠結(jié)局提供科學(xué)依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2019年1月-12月于第九○○醫(yī)院生殖中心首次行拮抗劑方案IVF/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕的UI患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次行拮抗劑方案治療；(2)經(jīng)腹腔鏡檢查或者輸卵管造影證實(shí)至少有一側(cè)輸卵管通暢，并至少行3周期人工授精(IUI)未孕；(3)年齡<38歲；(4)月經(jīng)規(guī)律，超聲證實(shí)有正常排卵；(5)基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)>7個(gè)，抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml；(6)男方精液未見明顯異常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)排卵障礙的患者，如多囊卵巢綜合征(PCOS)；(2)經(jīng)腹腔鏡或者輸卵管造影提示存在盆腔因素，如盆腔子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管梗阻或炎癥、盆腔結(jié)核、生殖道畸形等；(3)男方中重度少弱畸精子癥；(4)有自身免疫性疾病和遺傳病史；(5)合并存在影響IVF妊娠結(jié)局的相關(guān)疾病，如子宮腺肌癥、子宮肌瘤≥4 cm、未經(jīng)治療的輸卵管積水、未經(jīng)治療的子宮內(nèi)膜病變等；(6)未經(jīng)治療的內(nèi)分泌疾病，如：甲狀腺功能亢進(jìn)，高泌乳素血癥等；(7)夫妻雙方存在任何一方有染色體異常的情況。

本研究共納入U(xiǎn)I患者147個(gè)周期(UI 組)，選擇同時(shí)段和同年齡段就診的輸卵管阻塞因素(包含輕度的男方因素)不孕患者 341個(gè)周期為對(duì)照組。

二、研究方法

1.促排卵前準(zhǔn)備：月經(jīng)期第2～4天靜脈采血檢查血清促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)及AMH水平，近排卵期開始陰道超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育至排卵，并記錄AFC，排卵后1周左右開始行雌激素預(yù)處理至月經(jīng)第2天早晨。

2.拮抗劑方案促排卵：月經(jīng)第2天開始每天注射促性腺激素(Gn)，起始劑量150～225 U/d，適時(shí)調(diào)整Gn劑量，至最大卵泡直徑達(dá)12～13 mm，和(或)E2水平超過1 468 pmol/L，和(或)LH>5 U/L時(shí)加用醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾，瑞士)0.25 mg/d至HCG日。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm時(shí)，當(dāng)晚注射HCG(安徽豐原藥業(yè))6 000～10 000 U。

3.取卵及受精：注射HCG后36～38 h，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下行穿刺取卵術(shù)。根據(jù)當(dāng)天獲卵情況，優(yōu)先選擇行IVF受精，受精后5～6 h，拆除部分顆粒細(xì)胞觀察受精情況，若超過1/3的卵母細(xì)胞無受精征象，則進(jìn)行補(bǔ)救ICSI受精。

4.胚胎培養(yǎng)及移植：按照本生殖中心的常規(guī)操作進(jìn)行胚胎培養(yǎng)和評(píng)估[5]。再根據(jù)患者自身情況，選擇取卵后第3天新鮮卵裂胚1～2枚移植或全胚冷凍。鮮胚移植及凍融胚胎移植(FET)后均按照本生殖中心常規(guī)行黃體支持治療。

5.妊娠判斷：胚胎移植14 d后測(cè)定血清β-HCG水平，若β-HCG>25 U/L，則確定為HCG陽性。移植后28 d行陰道B超檢查，見孕囊者確定為臨床妊娠，包括宮內(nèi)妊娠和宮外妊娠。孕12周之前的胚胎丟失記為早期流產(chǎn)，孕12～28周的胚胎丟失記為中晚期流產(chǎn)。有胎兒活產(chǎn)(包括早產(chǎn))者為活產(chǎn)周期?；町a(chǎn)主要通過電話隨訪登記，電話隨訪至2021年12月。

6.觀察指標(biāo)：主要觀察指標(biāo)為成熟卵率、受精率、可移植胚胎率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、補(bǔ)救ICSI發(fā)生率、鮮胚移植臨床妊娠率、累積妊娠率及累積活產(chǎn)率。累積妊娠率=當(dāng)次取卵周期后首次獲得妊娠的例數(shù)(包括鮮胚移植與FET周期)/取卵周期數(shù)×100%。累積活產(chǎn)率=當(dāng)次取卵周期后首次獲得活產(chǎn)的例數(shù)(包括鮮胚移植與FET周期)/取卵周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者的基本資料比較

本研究共納入488個(gè)周期，包括147個(gè)UI周期患者和341個(gè)對(duì)照周期患者。兩組患者間的年齡、不孕年限、BMI、bFSH、bLH、bE2、AFC及AMH水平比較均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本資料比較

二、兩組患者的促排卵、胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局情況

1.兩組患者的促排卵情況：分析結(jié)果顯示，兩組間的Gn用量、扳機(jī)日內(nèi)膜厚度及激素水平和卵泡直徑大于14 mm 數(shù)目以及獲卵數(shù)等指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)；UI組的MⅡ卵率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者的促排卵結(jié)果

2.受精及胚胎發(fā)育情況：統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，UI組的IVF受精率、囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚的形成率均顯著降低(P<0.05)；UI組補(bǔ)救ICSI發(fā)生率有增加趨勢(shì)，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組的受精率、2PN受精率、2PN卵裂率、可移植胚胎率及D3優(yōu)胚率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者的受精及胚胎發(fā)育情況比較(%)

3.妊娠結(jié)局比較：兩組的鮮胚移植臨床妊娠率無顯著性差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，UI組累積妊娠率顯著降低(P<0.05)，累積活產(chǎn)率有降低趨勢(shì)但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表4)。UI組未獲得活產(chǎn)尚有冷凍胚胎周期數(shù)是5例，占3.40%(5/147)，對(duì)照組未獲得活產(chǎn)尚有冷凍胚胎周期數(shù)是15例，占4.40%(15/341)，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表4 兩組患者的妊娠結(jié)局比較

三、影響UI患者妊娠結(jié)局的多因素Logistic回歸分析

以妊娠結(jié)局為因變量(臨床妊娠、活產(chǎn)賦值=1，無臨床妊娠、未活產(chǎn)=0)，將臨床認(rèn)為與UI有關(guān)、單因素分析P<0.05的項(xiàng)目為自變量(年齡≤30歲=0，年齡>30歲=1)采用多因素Logistic回歸，逐步法排除無關(guān)項(xiàng)目。最終分析結(jié)果顯示：年齡是影響鮮胚移植臨床妊娠的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，年齡>30歲UI患者行鮮胚移植臨床妊娠的機(jī)會(huì)是年齡≤30歲UI患者的0.334倍；移植胚胎數(shù)是鮮胚移植臨床妊娠的保護(hù)因素(OR=3.055，P=0.038)。優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)是UI患者累積活產(chǎn)的保護(hù)因素(OR=7.493，P=0.000)(表5)。

表5 影響妊娠結(jié)局的多因素Logistic回歸分析

討 論

隨著晚婚晚孕、生活方式和環(huán)境因素的改變，越來越多的不孕患者尋求積極的治療，其中UI患者的數(shù)量也在明顯增加。抑郁、壓力和焦慮的問題顯著影響UI夫妻之間的感情。伴隨輔助生殖技術(shù)的迅速發(fā)展，IVF-ET技術(shù)被認(rèn)為是UI患者最后的醫(yī)治方式，因其具有更高的妊娠率及活產(chǎn)率，也是最為有效的診療方案[6-7]。許多UI患者認(rèn)為期待治療是“浪費(fèi)時(shí)間”，希望臨床醫(yī)生通過IVF技術(shù)來幫助其盡快成功妊娠[8]。指南[2]推薦應(yīng)參照對(duì)生育需求急迫程度，結(jié)合女性年齡、不孕年限等要素，給患者定制個(gè)體化的診療方案。目前開展UI病因研究并不多，本研究通過單因素分析發(fā)現(xiàn)UI患者IVF-ET治療過程中臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的特征，進(jìn)一步探討影響IVF妊娠結(jié)局的多因素來指導(dǎo)臨床工作。

年齡是影響妊娠的重要因素，女性年齡超過30歲，自然妊娠的能力開始下降，35～40歲時(shí)顯著下降。本研究多因素回歸分析提示UI患者年齡>30歲是鮮胚移植臨床妊娠的不利因素。指南[2]提出對(duì)于年齡小于35歲，不孕年限不足2年的UI患者，在6～12個(gè)月的期待治療后，若未孕則建議積極治療；而年齡大于35歲，不孕年限超過3年的UI患者推薦積極治療。隨著年齡的增長(zhǎng)，卵巢儲(chǔ)備功能下降，卵母細(xì)胞的數(shù)量及質(zhì)量均下降。有研究顯示UI女性較輸卵管因素或男性因素的不孕女性卵巢儲(chǔ)備功能下降[9-11]。本研究中，評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的指標(biāo)FSH、AMH、AFC在兩組中的結(jié)果相似(P>0.05)，可能跟選取年輕且卵巢功能正常的人群有關(guān)。卵母細(xì)胞數(shù)量對(duì)自然妊娠成功影響不大，但在IVF過程中卻很重要，因?yàn)樗鼈兡苡绊懤鄯e結(jié)果[12]。卵母細(xì)胞質(zhì)量差，在IVF治療過程中可表現(xiàn)為成熟卵母細(xì)胞比例降低、卵母細(xì)胞形態(tài)異常、受精潛能低、胚胎發(fā)育不良、囊胚形成率低等。導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量差的最常見原因是自然衰老，這與卵母細(xì)胞線粒體效率降低和氧化應(yīng)激增加密切相關(guān)；在年輕女性中，散發(fā)性基因突變可加速卵母細(xì)胞衰老，導(dǎo)致胚胎發(fā)育的嚴(yán)重缺陷[13]。Astbury等[14]認(rèn)為一些UI女性在IVF期間更容易產(chǎn)生不成熟的卵母細(xì)胞，這與卵母細(xì)胞質(zhì)量較差有關(guān)，反映在高水平的DNA損傷，可導(dǎo)致植入率和活產(chǎn)率顯著降低。因此卵母細(xì)胞的成熟，是成功受精及胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)，提高卵母細(xì)胞成熟比例，有助于提高卵母細(xì)胞利用率。吳銳等[15]研究認(rèn)為改進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)技術(shù)，有助于提高卵母細(xì)胞的利用率，減少激素用量，及降低OHSS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Haas等[16]研究認(rèn)為GnRH激動(dòng)劑(GnRHa)聯(lián)合HCG雙扳機(jī)可以增加卵母細(xì)胞的數(shù)量、成熟卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)囊胚的數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)年輕UI患者卵母細(xì)胞的成熟比例較對(duì)照組降低，對(duì)于卵母細(xì)胞成熟度較差的患者，可考慮行卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)技術(shù)，待卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ期，再行IVF/ICSI受精，將形成的胚胎行移植/冷凍處理；或者下一取卵周期延長(zhǎng)Gn天數(shù)，放大HCG日主導(dǎo)卵泡徑線，或延長(zhǎng)HCG扳機(jī)至取卵時(shí)間或在HCG日使用GnRHa聯(lián)合HCG雙扳機(jī)來增加卵母細(xì)胞的成熟比例。一項(xiàng)回顧性研究比較IVF與ICSI治療UI患者的效果，發(fā)現(xiàn)兩組患者受精失敗率相當(dāng)(P>0.05)，IVF組活產(chǎn)率顯著高于ICSI組(P<0.05)，ICSI治療增加了胚胎學(xué)家的工作量，同時(shí)也增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用，建議UI患者優(yōu)先行IVF受精[17]。本研究選用的精液大致正常，取卵當(dāng)天首先行IVF短時(shí)受精，若未受精的卵母細(xì)胞比例超過1/3，則進(jìn)行補(bǔ)救ICSI。UI組IVF受精率顯著降低(P<0.05)，補(bǔ)救ICSI發(fā)生率雖然不高(P>0.05)，但I(xiàn)VF結(jié)合補(bǔ)救ICSI，增加了部分UI患者卵母細(xì)胞的利用率，彌補(bǔ)了部分卵母細(xì)胞因質(zhì)量缺陷導(dǎo)致的受精失敗，使得兩組患者受精率相當(dāng)(P>0.05)。本研究UI組囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚的形成率均有顯著降低(P<0.05)，考慮年輕UI患者胚胎發(fā)育的潛能下降。在Siristatidis等[18]的研究中UI患者與其他因素不孕患者相比較，臨床妊娠率顯著降低(P<0.05)，活產(chǎn)率有下降趨勢(shì)(P>0.05)。本研究結(jié)果顯示，UI組的累積妊娠率顯著下降，累積活產(chǎn)率有下降趨勢(shì)，與上述研究結(jié)果一致。Ebner等[12]認(rèn)為年輕UI患者可能存在卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，表現(xiàn)為卵母細(xì)胞成熟比例降低、對(duì)受精潛力、胚胎發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。

本研究鮮胚移植選擇1～2個(gè)優(yōu)質(zhì)卵裂胚，移植胚胎數(shù)目的增加有利于鮮胚移植臨床妊娠，但同時(shí)也增加了多胎妊娠及產(chǎn)科風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)過囊胚培養(yǎng)可以篩選出發(fā)育潛能更好的胚胎，同時(shí)囊胚移植提高了子宮內(nèi)膜窗口期與胚胎的同步性，從而提高了活產(chǎn)率[19]。FET移植優(yōu)選優(yōu)質(zhì)單囊胚，對(duì)于卵巢儲(chǔ)備功能正常的<38歲的UI患者來說，弱化了年齡對(duì)累積活產(chǎn)的影響，使其不再是影響累積活產(chǎn)的主要因素。獲得更多的優(yōu)質(zhì)囊胚可明顯增加累積活產(chǎn)的機(jī)會(huì)。

綜上所述，本研究排除了高齡、免疫等導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能下降的情況，也排除了合并存在影響IVF結(jié)局的病理情況如子宮腺肌癥、未經(jīng)治療的子宮內(nèi)膜病變等，同時(shí)排除了中重度男方少弱畸精癥導(dǎo)致的受精障礙，采用首次行拮抗劑方案的病例，避免混雜因素過多產(chǎn)生偏倚。兩組病例未進(jìn)行FET情況的比較，缺乏凍胚移植妊娠結(jié)局相關(guān)因素的分析，以后會(huì)逐步開展針對(duì)這部分的研究設(shè)計(jì)。UI患者存在潛在的累積活產(chǎn)下降的情況，可能與卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能下降有關(guān)。年齡>30歲不利于UI患者鮮胚移植妊娠，增加移植胚胎數(shù)有利于鮮胚移植臨床妊娠；優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)是年輕UI患者累積活產(chǎn)很好的預(yù)測(cè)因子，但如何增加患者優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)量是臨床和實(shí)驗(yàn)室需要去共同探討的問題。