新鮮ICSI移植周期D3胚胎卵裂球數(shù)目與助孕結(jié)局相關(guān)性研究

田文曲，郭娜，任新玲，馬冰馨，姚青云，李倪捷，李鈺瑩

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖中心，武漢 430000)

近年來(lái)，隨著人口老齡化、不良生活方式、環(huán)境惡化、工作壓力等多重因素的加劇，男性不育患者的數(shù)量逐年上升，男性因素引起的不育占不孕癥的40%左右[1]。盡管卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)在治療男性不育方面具有較好的臨床效果，但I(xiàn)CSI技術(shù)帶來(lái)的醫(yī)源性子代安全問(wèn)題亟需引起人們關(guān)注。輔助生殖技術(shù)(ART)的首要目標(biāo)是選擇具有高發(fā)育潛力的胚胎，實(shí)現(xiàn)單胎健康活產(chǎn)。第三天(D3)新鮮卵裂期胚胎移植是目前許多生殖中心常用的移植策略，通常根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)分細(xì)則比如卵裂球的數(shù)量、碎片化程度、卵裂球的均勻度等形態(tài)學(xué)指標(biāo)來(lái)選擇胚胎進(jìn)行移植。有報(bào)道認(rèn)為D3卵裂球數(shù)量代表胚胎的卵裂率，被認(rèn)為是預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛力和妊娠結(jié)局的最關(guān)鍵指標(biāo)[2]，且許多研究表明細(xì)胞數(shù)量與胚胎發(fā)育潛力相關(guān)[2-3]。然而，臨床上對(duì)于ICSI來(lái)源的胚胎其卵裂球數(shù)量與新生兒結(jié)局的相關(guān)性研究報(bào)道較少。隨著ICSI應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大以及單胚胎移植策略的廣泛應(yīng)用，有必要確定一套非侵入性、性價(jià)比高且實(shí)用的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)指導(dǎo)ICSI周期單胚胎選擇。因此，本研究擬通過(guò)回顧性分析新鮮ICSI移植周期患者的臨床資料，探討新鮮ICSI移植周期D3胚胎卵裂球細(xì)胞數(shù)對(duì)ART妊娠結(jié)局及新生兒子代的影響，為進(jìn)一步改善新鮮ICSI移植周期胚胎選擇策略、提高單胚胎移植成功率以及優(yōu)生優(yōu)育提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

回顧性分析2018年1月至2020年12月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心行ICSI治療的2 618個(gè)周期的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)新鮮D3卵裂期單胚胎移植；(2)夫妻雙方染色體核型正常；(3)女方宮腔形態(tài)正常，無(wú)不良孕產(chǎn)史及反復(fù)流產(chǎn)病史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)染色體異常患者；(2)子宮畸形及其他內(nèi)分泌代謝性疾?。?3)數(shù)據(jù)缺失周期。

根據(jù)D3移植胚胎的卵裂球數(shù)目共分為6組：≤6細(xì)胞組(78例)、7細(xì)胞組(199例)、8細(xì)胞組(1 936例)、9細(xì)胞組(178例)、10細(xì)胞組(163例)和≥11細(xì)胞組(64例)。該研究的實(shí)施通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者夫妻雙方了解并知情同意。

二、研究方法

1.促排卵方案及取卵：患者均采用本中心常規(guī)的GnRH-a長(zhǎng)方案、拮抗劑方案或超長(zhǎng)方案促排卵，根據(jù)卵巢反應(yīng)性調(diào)整促排藥物劑量，依據(jù)卵巢激素水平和陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育。若B超監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)有3個(gè)以上主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到≥18 mm時(shí)，當(dāng)晚給予肌肉注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)250 μg或人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)8 000～10 000 U誘發(fā)排卵，HCG注射36～37 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。

2.胚胎培養(yǎng)、評(píng)估及移植：ICSI授精后16～18 h觀察卵母細(xì)胞受精情況，受精后第2天(D2)、第3天(D3)觀察胚胎卵裂情況，記錄胚胎卵裂球細(xì)胞數(shù)、碎片化程度、細(xì)胞大小均一度。移植胚胎的選擇主要根據(jù)D3胚胎形態(tài)，兼顧考慮原核期和D2胚胎形態(tài)。挑選1枚D3卵裂期胚胎進(jìn)行移植，其余胚胎進(jìn)行冷凍或繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期冷凍。原則上優(yōu)先選擇D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎進(jìn)行移植，若無(wú)優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎則在患者知情同意后選擇非優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。

3.觀察指標(biāo)：臨床妊娠定義為胚胎移植后4周經(jīng)陰道超聲檢查見(jiàn)孕囊者，臨床妊娠率=該組臨床妊娠周期數(shù)/該組總周期數(shù)×100%。若患者出現(xiàn)臨床妊娠，但在后續(xù)發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)胚胎停育或因發(fā)現(xiàn)胎兒畸形而人為終止妊娠者，該周期妊娠結(jié)局定義為流產(chǎn)，流產(chǎn)率=該組流產(chǎn)周期數(shù)/該組妊娠周期數(shù)×100%。胎兒娩出并具有生命體征的周期，結(jié)局定義為活產(chǎn)，活產(chǎn)率=該組活產(chǎn)周期數(shù)/該組總周期數(shù)×100%。在活產(chǎn)周期中，妊娠滿20周但在37周前分娩的新生兒為早產(chǎn)兒；出生體重<2 500 g的新生兒為低出生體重兒；出生體重>4 000 g的新生兒為巨大兒。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 28.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)分布，發(fā)現(xiàn)各研究指標(biāo)均不滿足正態(tài)分布和方差齊性，計(jì)量資料以中位數(shù)(最小值～最大值)[M(min，max)]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用R×C列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在將每組與8細(xì)胞組進(jìn)行比較時(shí)，依據(jù)用于多重比較的Bonferroni校正，校正后P<0.01被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

各組間患者移植時(shí)年齡、基礎(chǔ)促卵泡生成素(bFSH)、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、原發(fā)不孕比例、不孕年限及子宮內(nèi)膜厚度等指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者的基線資料比較[M(min，max)，n(%)]

二、各組患者的妊娠結(jié)局比較

在新鮮ICSI移植周期中，8細(xì)胞組臨床妊娠率、活產(chǎn)率顯著高于≤6細(xì)胞組、7細(xì)胞組和9細(xì)胞組(P<0.01)；10細(xì)胞組和≥11細(xì)胞組臨床妊娠率和活產(chǎn)率略低于8細(xì)胞組，差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)(表2)?！?細(xì)胞組中5細(xì)胞移植周期活產(chǎn)1例，6細(xì)胞移植周期活產(chǎn)8例。

表2 各組間妊娠結(jié)局比較(%)

三、新生兒結(jié)局比較

各組間活產(chǎn)嬰兒的孕周、男嬰占比、出生體重、早產(chǎn)兒、巨大兒等指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)，但7細(xì)胞組低出生體重兒占比顯著高于8細(xì)胞組(P<0.01)(表3)。各組均無(wú)出生缺陷兒出生，有7個(gè)妊娠周期在產(chǎn)檢過(guò)程中發(fā)現(xiàn)胎兒發(fā)育異常，包括1例骨畸形(移植8細(xì)胞)，3例心臟發(fā)育畸形(2例8細(xì)胞、1例10細(xì)胞)，1例宮內(nèi)發(fā)育遲緩(8細(xì)胞)，2例胎兒染色體異常(1例8細(xì)胞、1例7細(xì)胞)，均及時(shí)行引產(chǎn)手術(shù)。

表3 各組間新生兒結(jié)局的比較[M(min，max)，n(%)]

討 論

1992年卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)的問(wèn)世解決了男性不育的難題，ICSI憑借其高受精率和可以降低完全受精失敗風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。與此同時(shí)，人們卻不得不關(guān)注其所帶來(lái)的醫(yī)源性子代安全性問(wèn)題。隨著臨床個(gè)體化控制性卵巢刺激方案的改進(jìn)和胚胎培養(yǎng)體系的精準(zhǔn)提高，新鮮周期胚胎移植策略不僅可以獲得較高的臨床妊娠率，還可以避免胚胎冷凍復(fù)蘇損傷的風(fēng)險(xiǎn)，因此受到越來(lái)越多患者的親睞[4-5]。鑒于ICSI廣泛應(yīng)用以及D3新鮮卵裂期胚胎移植是當(dāng)今許多輔助生殖中心的常規(guī)做法，本研究將重點(diǎn)關(guān)注ICSI來(lái)源胚胎卵裂球數(shù)量對(duì)新鮮單胚胎移植周期妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響，以期為臨床提供更好的單胚胎選擇策略，提高臨床妊娠率，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

目前，胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估依然是各大生殖中心最主要和最常用的評(píng)估方法。如何提高這種方法的有效性也是臨床和實(shí)驗(yàn)室工作的重點(diǎn)。評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)通常由卵裂球數(shù)目、細(xì)胞均一性和碎片化程度決定。卵裂球數(shù)目被認(rèn)為是預(yù)測(cè)囊胚形成、胚胎植入率和活產(chǎn)率最關(guān)鍵的指標(biāo)之一。目前，普遍認(rèn)為第3天(D3)8細(xì)胞胚胎具有最好的發(fā)育潛能，而細(xì)胞數(shù)較少的胚胎預(yù)后較差[2-3，6]。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，4～5和6細(xì)胞組的胚胎著床率和臨床妊娠率明顯低于7～9和>9細(xì)胞組，而流產(chǎn)率則明顯增高；6細(xì)胞組D3胚胎著床率和臨床妊娠率明顯下降，不屬于優(yōu)質(zhì)胚胎。本研究也發(fā)現(xiàn)≤6細(xì)胞組D3胚胎臨床妊娠率低，流產(chǎn)率增加，可能與卵裂球數(shù)目低的D3胚胎發(fā)生非整倍體風(fēng)險(xiǎn)高有關(guān)。目前一致認(rèn)為慢分裂胚胎發(fā)育潛能低，而對(duì)于快分裂胚胎的發(fā)育能力仍存有爭(zhēng)議。有研究報(bào)道，活產(chǎn)率與細(xì)胞數(shù)增加至8細(xì)胞呈正相關(guān)，而細(xì)胞數(shù)超過(guò)8細(xì)胞則活產(chǎn)率降低[8]。有研究在研究胚胎發(fā)育和倍性的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，快速分裂的胚胎染色體畸變率更高[9]。Kroener等[10]建議優(yōu)先移植6～9細(xì)胞的胚胎，而不是>9細(xì)胞胚胎。然而，Pons等[11]研究結(jié)果提示9～11細(xì)胞胚胎的整倍體率低于8細(xì)胞胚胎，而11細(xì)胞以上的胚胎獲得整倍體囊胚的概率與8細(xì)胞相同，當(dāng)分裂胚胎的整倍體囊胚被移植時(shí)，可表現(xiàn)出與8細(xì)胞胚胎的整倍體囊胚相似的植入率和活產(chǎn)率。本研究結(jié)果也提示優(yōu)先推薦8細(xì)胞胚胎進(jìn)行移植，其次為≥11細(xì)胞胚胎和10細(xì)胞胚胎；9細(xì)胞胚胎和7細(xì)胞胚胎具有相似的臨床結(jié)局，但7細(xì)胞組胚胎低出生體重兒風(fēng)險(xiǎn)增加；≤6細(xì)胞胚胎臨床結(jié)局最差，但依然有健康活產(chǎn)的機(jī)會(huì)。

利用延時(shí)成像技術(shù)對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行非侵入性觀察是近期提出的一種更好的胚胎活力評(píng)估方法，它可以記錄和注釋胚胎發(fā)育的信息，通過(guò)特定參數(shù)對(duì)胚胎發(fā)育潛能和妊娠結(jié)局進(jìn)行預(yù)測(cè)。有研究認(rèn)為從一個(gè)到三個(gè)卵裂球的直接卵裂、四細(xì)胞階段的多核化以及兩細(xì)胞階段的卵裂球大小均會(huì)影響胚胎活力和植入潛能[2]。胚胎活力還與受精時(shí)開(kāi)始的一系列嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞事件相關(guān)[12]。盡管該技術(shù)在當(dāng)代 ART 應(yīng)用中占據(jù)了重要地位，但技術(shù)改進(jìn)以及開(kāi)發(fā)用于選擇最可行胚胎的有效算法目前還不夠理想。延時(shí)成像技術(shù)的臨床有效性和安全性一直存有爭(zhēng)議[13]。當(dāng)前延時(shí)成像系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)之一是胚胎培養(yǎng)組件不允許胚胎旋轉(zhuǎn)，尤其是當(dāng)卵裂球重疊或存在大量的細(xì)胞質(zhì)碎片時(shí)，目視觀察變得有所“失真”[14]，甚至這種胚胎“美顏”的效果圖并不能真實(shí)反映胚胎的植入潛能，從而為胚胎選擇帶來(lái)一定誤導(dǎo)。其次，胚胎每5～15 min暴露于內(nèi)置攝像系統(tǒng)的光照下，如果計(jì)算整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中每個(gè)胚胎拍攝圖像總數(shù)，光照周期會(huì)大大增加，其安全性問(wèn)題則值得擔(dān)憂[15]。此外，成本/效益比也是一個(gè)非常重要的因素，延時(shí)培養(yǎng)系統(tǒng)不僅價(jià)格昂貴，而且還需要專業(yè)人士定期進(jìn)行維護(hù)，這對(duì)于生殖周期有限的中心來(lái)說(shuō)實(shí)用價(jià)值有限。因此，在現(xiàn)有形態(tài)學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，確定一套實(shí)用、廉價(jià)、非侵入性的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)提高胚胎選擇效率就具有十分重要的意義。本研究也存在一定的局限性。本研究是一項(xiàng)針對(duì)新鮮胚胎移植周期的單中心回顧性研究，無(wú)法排除新鮮周期高雌激素環(huán)境對(duì)胚胎植入的可能影響。有關(guān)D3胚胎卵裂球數(shù)目與胚胎倍性的相關(guān)性，有待后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證，以完善此評(píng)估方法，證實(shí)其臨床有效性。

綜上所述，當(dāng)同時(shí)存在多個(gè)可供移植的胚胎時(shí)，推薦優(yōu)先移植8細(xì)胞胚胎。此外，10個(gè)以上細(xì)胞的胚胎也表現(xiàn)出較好的臨床結(jié)局。本研究結(jié)果表明，D3胚胎的卵裂球數(shù)量可作為移植前胚胎評(píng)估與篩選的標(biāo)準(zhǔn)之一，有助于在臨床實(shí)踐中提高新鮮周期單胚胎移植的成功率。